Обнаружение языка относится к определению языка, на котором написан данный текст. Это проблема категоризации текста по сути, причем языки являются классами.

Эта категоризация становится важной, когда язык входных данных не предполагается. Например, функция определения языка в Google Translate определяет язык вводимого текста перед его переводом.

В этой статье мы классифицируем текстовые данные на 22 языка — арабский, китайский, голландский, английский, эстонский, французский, хинди, индонезийский, японский, корейский, латынь, персидский, португальский, пушту, румынский, русский, испанский, шведский, Тамильский, тайский, турецкий, урду.

Реализация идеи на cAInvas — здесь!

On Kaggle, автор Zara Jamshaid

WiLI-2018, эталонный набор данных по идентификации языков Википедии, содержащий 235000 абзацев на 235 языках.

После выбора данных и предварительной обработки 22 языка из исходного набора данных были выбраны для создания текущего набора данных.

Каждый язык в этом наборе данных содержит 1000 строк / абзацев. Набор данных представляет собой CSV-файл, состоящий из 1000 образцов текста на 22 языках каждый, что составляет в общей сложности 22 тыс. Образцов в наборе данных.

Взгляд на разброс значений по классам —

Это идеально сбалансированный набор данных.

Вот один пример текста на каждом языке из набора данных —

Если мы внимательно рассмотрим образцы, мы увидим, что в образце урду мало английских слов и транслитерированные слова тоже на тайском языке! Это может привести к неоднозначности во время прогнозирования.

Одно горячее кодирование

Это проблема классификации нескольких классов, когда классы не имеют зависимости от диапазона. Таким образом, языки кодируются в горячем режиме для целей классификации.

Это делается с помощью функции get_dummies () модуля pandas. Drop_first остается False, поскольку эта кодировка предназначена для меток классов.

Столбцы закодированного кадра данных столбца сохраняются, чтобы помочь в декодировании значений выходного класса позже.

Пакет кодирования слов

Модель пакета слов представляет множество слов в предложении.Грамматика или порядок слов значения не имеют.

Для реализации используется функция CountVectorizer () модуля sklearn.feature_extraction.text. Используются только 1-граммовые (одно слово) токены, а количество извлеченных функций ограничено 20000. Поскольку логически обучающий набор — это единственные данные, которые нам разрешено видеть или работать с ними во время обучения модели, в то время как используются два других. Чтобы настроить / оценить его производительность, эта модель подходит для обучающих текстовых данных и используется для преобразования всех трех наборов текстовых данных — обучения, проверки и тестирования.

Разделение на проверку-проверка-поезд

Использование соотношения 80–10–10 для разделения фрейма данных на наборы проверки проверки-обучения. Затем они делятся на X и y (вход и выход) для дальнейшей обработки.

Стандартизация

Стандартизация помогает центрировать и масштабировать значения, чтобы получить среднее значение 0 и стандартную дисперсию 1. Это гарантирует, что ни одна из функций не получит более высокий вес по сравнению с другими.

Функция StandardScaler в sklearn.Модуль предварительной обработки используется для реализации этой концепции. Подобно пакету кодирования слов, экземпляр соответствует обучающим данным и используется для преобразования обучающих, проверочных и тестовых данных.

Модель представляет собой простую модель с 4 плотными слоями, 3 из которых имеют функции активации ReLU, а последний имеет функцию активации Softmax для преобразования значений последнего слоя в распределение вероятностей.

Модель скомпилирована с использованием категориальной функции кросс-энтропийных потерь, поскольку последний уровень модели имеет функцию активации softmax, а метки закодированы в горячем режиме.Используется оптимизатор Adam, и точность модели отслеживается по эпохам.

Функция обратного вызова EarlyStopping отслеживает потерю проверки и останавливает обучение, если она не уменьшается в течение 5 периодов непрерывно. Параметр restore_best_weights гарантирует, что модель с наименьшими потерями при проверке будет восстановлена ​​в переменной модели.

Модель была обучена сначала со скоростью обучения 0,001, а затем со скоростью обучения 0,0001.

Модель достигла точности ~ 94.7% на тестовой выборке.

Чем больше набор данных, тем лучше результаты.

Построение матрицы неточностей для лучшего понимания результатов —

Мы видим, что 3% текстов на урду были предсказаны на английском языке. Это может быть связано с расхождениями, которые мы видели ранее в значениях набора данных.

Давайте выполним прогнозы на случайных выборках тестовых данных —

Библиотека, компилятор и структура вывода deepC предназначены для включения и выполнения глубокого обучения нейронные сети, сосредоточив внимание на особенностях устройств малого форм-фактора, таких как микроконтроллеры, eFPGA, процессоры и другие встроенные устройства, такие как raspberry-pi, odroid, Arduino, SparkFun Edge, RISC-V, мобильные телефоны, ноутбуки x86 и arm, среди прочего .

Компиляция модели с использованием deepC —

Перейдите на платформу cAInvas (ссылка на записную книжку приведена ранее) и проверьте прогнозы в файле .exe!

Кредиты: Ayisha D

AITS Значения | Что означает AITS?

Политика конфиденциальности — AITS.

Настоящая Политика конфиденциальности регулирует способ, которым AFFLUENT IT SERVICES собирает, использует, поддерживает и раскрывает информацию, полученную от пользователей (каждый, «Пользователь») веб-сайта http://www.aits.ooo («Сайт»).

Личная идентификационная информация

Мы можем собирать личную идентификационную информацию от пользователей различными способами, включая, помимо прочего, когда пользователи посещают наш сайт, регистрируются на сайте, размещают заказ, заполняют форму и в связи с другими действиями, услугами. , функции или ресурсы, которые мы предоставляем на нашем Сайте.При необходимости у пользователей могут быть запрошены имя, адрес электронной почты, номер телефона. Однако пользователи могут посещать наш сайт анонимно. Мы будем собирать личную идентификационную информацию от пользователей, только если они добровольно предоставят нам такую ​​информацию. Пользователи всегда могут отказаться предоставлять личную идентификационную информацию, за исключением того, что это может помешать им участвовать в определенных действиях, связанных с Сайтом.

Неличная идентификационная информация

Мы можем собирать неличную идентификационную информацию о пользователях всякий раз, когда они взаимодействуют с нашим сайтом.Неличная идентификационная информация может включать имя браузера, тип компьютера и техническую информацию о средствах подключения пользователей к нашему сайту, таких как операционная система и используемые поставщики интернет-услуг, а также другую подобную информацию.

Файлы cookie веб-браузера

Наш сайт может использовать файлы cookie для улучшения взаимодействия с пользователем. Веб-браузер пользователя размещает файлы cookie на их жестком диске для ведения учета, а иногда и для отслеживания информации о них.Пользователь может настроить свой веб-браузер так, чтобы он отказывался от файлов cookie или предупреждал вас об отправке файлов cookie. Если они это сделают, обратите внимание, что некоторые части Сайта могут работать некорректно.

Как мы используем собранную информацию

AFFLUENT IT SERVICES может собирать и использовать личную информацию пользователей для следующих целей:

• Для запуска и работы нашего Сайта
  Нам может потребоваться, чтобы ваша информация отображала контент на Сайте правильно.
• Для улучшения обслуживания клиентов
  Предоставляемая вами информация помогает нам более эффективно реагировать на ваши запросы в службу поддержки и поддержку.
• Для персонализации взаимодействия с пользователем
  Мы можем использовать информацию в совокупности, чтобы понять, как наши Пользователи как группа используют услуги и ресурсы, предоставляемые на нашем Сайте.
• Для улучшения нашего Сайта
  Мы можем использовать ваши отзывы для улучшения наших продуктов и услуг.
• Для периодической отправки электронных писем
  Мы можем использовать адрес электронной почты для отправки информации о пользователях и обновлений, касающихся их заказа. Его также можно использовать для ответа на их запросы, вопросы и / или другие запросы.

Как мы защищаем вашу информацию

Мы применяем соответствующие методы сбора, хранения и обработки данных, а также меры безопасности для защиты от несанкционированного доступа, изменения, раскрытия или уничтожения вашей личной информации, имени пользователя, пароля, информации о транзакциях и данных, хранящихся на нашем Сайте.

Предоставление личной информации

Мы не продаем, не обмениваем и не сдаем в аренду личную идентификационную информацию пользователей третьим лицам.Мы можем передавать общую агрегированную демографическую информацию, не связанную с какой-либо личной идентификационной информацией о посетителях и пользователях, нашим деловым партнерам, доверенным аффилированным лицам и рекламодателям для целей, изложенных выше.

Электронные информационные бюллетени

Если Пользователь решит подписаться на наш список рассылки, он будет получать электронные письма, которые могут включать в себя новости компании, обновления, информацию о связанных продуктах или услугах и т. Д.

Изменения в этой политике конфиденциальности

AFFLUENT IT SERVICES имеет право по своему усмотрению обновить эту политику конфиденциальности в любое время.Когда мы это сделаем, мы разместим уведомление на главной странице нашего Сайта. Мы рекомендуем пользователям часто проверять эту страницу на предмет изменений, чтобы оставаться в курсе того, как мы помогаем защитить личную информацию, которую мы собираем. Вы признаете и соглашаетесь с тем, что вы обязаны периодически просматривать эту политику конфиденциальности и узнавать об изменениях.

Вы принимаете эти условия

Используя этот Сайт, вы подтверждаете свое согласие с этой политикой. Если вы не согласны с этой политикой, пожалуйста, не используйте наш Сайт.Дальнейшее использование вами Сайта после публикации изменений в этой политике будет считаться вашим согласием с этими изменениями.

Как с нами связаться

Если у вас есть какие-либо вопросы об этой Политике конфиденциальности, практике этого сайта или ваших отношениях с этим сайтом, пожалуйста, свяжитесь с нами по адресу [email protected] .

Необходимость локализации пользователей и анонимной идентификации лиц с ограниченными возможностями

[13] В. Миланес, Д. Ф. Льорка, Дж.Villagr´

a, J. P´

erez, I. Parra, C. Gonz´

alez,

и MA Sotelo, «Система активной безопасности на основе технического зрения для автоматического останова

», Экспертные системы с приложениями , т. 39, нет. 12. С. 11234–

11 242, 2012.

[14] Ю. Малиновский, Ю.-Ж. Ву и Ю. Х. Ван, «Видеонаблюдение

пешеходов на сигнальных перекрестках», Транспорт

Research Record, vol. 2073, стр. 11–17, 2008.

[15] Дж. Версавель, «Защита участников дорожного движения с помощью интеллектуальных камер наблюдения:

Повышение безопасности пешеходов с помощью технологии обработки видеоизображений»,

15-й Всемирный конгресс по интеллектуальным транспортным системам, 2008 г.

[16] Л. Буде и С. Мидене, «Обнаружение пешеходных переходов на основе

доказательств слияния видеодатчиков», Транспортные исследования, часть C,

vol. 17, нет. 5, pp. 484–497, 2009.

[17] К. Исмаил, Т. Сайед, Н.Сонье и К. Лим, «Автоматический анализ

конфликтов между пешеходами и транспортными средствами с использованием видеоданных», Transportation Research

Record, vol. 2140, pp. 44–54, 2009.

[18] Т. Моррис, X. Ли, В. Мореллас и Н. Папаниколопулос, «Видеообнаружение

и классификация пешеходных событий на перекрестках и пешеходных переходах»,

Tech. Rep., 2013.

[19] С. Колер, М. Голдхаммер, С. Бауэр, С. Зеха, К. Долл, У. Брунсманн,

и К. Дитмайер, «Стационарное обнаружение намерения пешехода на

перекрестков.”Журнал IEEE Intelligent Transportation Systems Magazine, vol. 5,

нет. 4, pp. 87–99, 2013.

[20] М. С. Ширази и Б. Моррис, «Контекстная комбинация внешнего вида и движения

для видеороликов о перекрестках с транспортными средствами и пешеходами», Лекция

Notes in Computer Science, vol. 8887, pp. 708–717, 2014.

[21] С. ´

Альварес, Д.Ф. Льорка и М.А. Сотело, «Иерархическая камера

, автоматическая калибровка для систем наблюдения за дорожным движением», Expert Systems with

Applications, т.41, pp. 1532–1542, 2014.

[22] М. Голдхаммер, Э. Стригель, Д. Мейснер, У. Брунсманн, К. Долл,

и К. Дитмайер, «Совместная мультисенсорная сеть для безопасности дорожного движения.

приложений на перекрестках »на 15-й Международной конференции IEEE по

Интеллектуальных транспортных системах, 2012 г.

[23] У. Фаворил,« ​​Обнаружение пешеходов для повышения безопасности движения и эффективности

на сигнальных перекрестках »в 8-м Международная конференция IEEE

по расширенному видеонаблюдению и видеонаблюдению, 2011 г.

[24] Д.Ф. Льорка, И. Парра, Р. Кинтеро, К. Ферн

андес, Р. Искьердо и MA

Сотело, «Обнаружение пешеходов на пешеходных переходах на основе стереозвука.

Оценка поведенческого моделирования, »В ICINCO2014, Международная конференция по информатике в управлении, автоматизации и робототехнике, Международная конференция

, 2014.

[25] Б. Фольц, Х. Меленц, Г. Агаменнони и Р. Зигварт,« Оценка актуальности характеристики

для изучение поведения пешеходов на пешеходных переходах »,

на 18-й Международной конференции IEEE по интеллектуальному транспорту

Systems, 2015.

[26] Дж. Чжоу и Дж. Ши, «Поиск алгоритмов и приложений для локализации

обзор», Journal of Intelligent Manufacturing, vol. 20, нет. 6, pp. 695–

707, 2009.

[27] Х. Лю, Х. Дараби, П. Банерджи и Дж. Лю, «Обзор беспроводных методов и систем позиционирования внутри помещений

», IEEE Transactions on Systems,

Человек и кибернетика — Часть C, т. 37, нет. 6, pp. 1067–1080, 2007.

[28] Т. Джерма, Ф. Лерасле, Н. Уада и В.Каденат, «Объединение данных Vision и rfd

для отслеживания людей в воронах с помощью мобильного робота», Computer Vision

and Image Understanding, vol. 114, pp. 641–651, 2010.

[29] Т. Ник, С. Кордес, Дж. Готце и У. Джон, «Локализация с помощью камеры

пассивных RF-этикеток», в International Conference on Indoor Positioning

and Indoor Navigation, 2012.

[30] F. Schwiegelshohn, T. Nick и J. Gotze, «Локализация на основе

слияния данных радио- и стереоизображения», в 10-м семинаре по позиционированию

Navigation и коммуникации (WPNC), 2013.

[31] Т. Мияки, Т. Ямасаки и К. Айзава, «Отслеживание людей с использованием частиц

— фильтр, объединяющий визуальную и беспроводную локализацию для широко распространенной камеры»,

на Международной конференции IEEE по обработке изображений (ICIP). )., 2007.

[32] A. de San Bernabe, JRM d. Диос и А. Оллеро, «Механизмы эффективной интеграции rssi

в локализацию и отслеживание с беспроводными сетями камер

», Международная конференция IEEE / RSJ по интеллектуальным роботам и системам

(IROS), 2013.

[33] Л. Радаэлли, Й. Моисей и К. С. Йенсен, «Использование камер для улучшения определения местоположения внутри помещений на основе Wi-Fi», Конспект лекций по информатике, вып.

8470, стр. 166–183, 2014.

[34] М. Голлер, К. Файхтенхофер и А. Пинц, «Слияние данных и компьютерного зрения для вероятностной локализации тегов», Международная конференция IEEE.

по RFID (IEEE RFID), 2014.

[35] Д.Ф. Льорка, Р. Кинтеро, И. Парра, Р. Искьердо, К. Фернндес и М.A.

Sotelo, «Вспомогательные пешеходные переходы с помощью стереолокализации

и RFID анонимной идентификации инвалидности», IEEE Intelligent Trans-

Portation Systems Conference (ITSC), 2015.

[36] AT Parameswaran, MI Husa и С. Упадхьяя, «Является ли rssi надежным параметром

в алгоритмах локализации датчиков, экспериментальным исследованием», в

Field Failure Data Analysis Workshop, 2009.

[37] К. Хёртефе и Ф. Валуа, «Is rssi хороший выбор для локализации в беспроводной сенсорной сети

? » в 26-й Международной конференции IEEE по

Advanced Information Networking and Applications (AINA), 2012.

[38] А. Исаси, С. Родригес, JLD Armentia, и А. Виллодас, «Местоположение,

отслеживание и идентификация с помощью слияния данных RF и Vision», 2010 г.

Европейский семинар по смарт-объектам: системы, технологии и

Applications (RFID Sys Tech), 2010.

[39] X. Zhao, Z. Xiao, and AM. Н. Т. Ю. Рен, «Бетл измеряет

по сравнению с Wi-Fi?» сравнение характеристик определения местоположения внутри помещений »на 20-й Европейской конференции по беспроводной связи

, 2014 г.

[40] S. ´

Альварес, М.А. Сотело, Д.Ф. Льорка, Р. Кинтеро и О. Маркос,

«Обнаружение целей на основе монокулярного зрения на динамических транспортных инфраструктурах

», конспект лекций Наука, т. 6927, pp. 576–583,

2012.

[41] I. Parra, DF Llorca, MA Sotelo, LM Bergasa, PR de Toro,

J. Nuevo, M. Ocana и MA Garc´

ıa-Garrido., «Комбинация методов извлечения функции

для обнаружения пешеходов svm», IEEE Transactions on

Intelligent Transportation Systems, vol.8, вып. 2, pp. 292–307, 2007.

[42] С. Блэкман, Р. Пополи, Проектирование и анализ современных систем слежения

. Artech House, 1999.

David Fern´

andez-Llorca получил M.S. и

со степенью доктора наук в области телекоммуникаций

от Университета Алькала

a (UAH), Мадрид, Испания,

в 2003 и 2008 годах соответственно. В настоящее время работает

доцентом по грн. Он является автором

более 90 реферируемых публикаций в

международных журналах, глав книг и материалов конференций.

Его исследовательские интересы сосредоточены на компьютерных системах видеонаблюдения и интеллектуальных транспортных системах. Д-р Ф.-

Льорка в настоящее время является помощником редактора IEEE

«Транзакции по интеллектуальным транспортным системам».

Он получил награду IEEE ITSS Outstanding Application Award 2013, награду Best

Young Researcher Award в гривне в 2013 году, премию Best PhD от

гривен в 2008 году, награду за лучшее исследование в области автомобилей

и транспортных средств. Заявки в Испании в 2008 году, награда 3M Foundation Awards в категории

в категории eSafety в 2009 году, награда MSc Thesis Award в области электронной безопасности от

ADA за лекцию в Техническом университете Мадрида в 2004 году и награду

Best Telecommunication Engineering Student Award от IVECO в 2004 году.

Ra´

ul Quintero M´

Inguez получил M.S. степень

в области компьютерных наук Университета

Алкала

a (UAH), Мадрид, Испания, в 2009 году. Он

, в настоящее время является научным сотрудником отдела компьютерной инженерии

в гривне и он работает

над своей докторской степенью в пешеходной тропе, намерении и

прогнозировании поз. Он был основным автором лучшего рабочего доклада

на IEEE ITSC2015.Его исследования в области

интересов включают обнаружение пешеходов, компьютерное зрение, интеллектуальные транспортные системы

и интеллектуальные автомобили

автомобилей.

Игнасио Парра Алонсо получил M.S. и докторская степень

в области инженерии телекоммуникаций от

Университета Алькала

a (грн.) в 2005 и 2010 годах,

соответственно. В настоящее время работает доцентом кафедры вычислительной техники

, грн.Его исследовательские интересы включают интеллектуальные транспортные системы

, интеллектуальные транспортные средства, искусственное зрение и операционные системы

. Доктор Парра Алонсо повторно получил премию за магистерскую диссертацию в области электронной безопасности от

, лекцию ADA в Техническом университете

в Мадриде, Испания, в 2006 году и премию 3M Foundation

в категории электронной безопасности в 2009 году.

Толстый револьверный инструмент iSeries ™ | Инновационная оснастка для штамповочного пресса

Линия инструментов iSeries ™ полностью совместима с системой идентификации инструментов AITS®.Все ключевые компоненты имеют лазерную маркировку с кодом матрицы данных, который содержит уникальный серийный номер для этого компонента. Система сканирует и сохраняет данные об инструментах под этим серийным номером из этого кода, что позволяет автоматизировать инвентаризацию инструментов и управлять ими.

• Код матрицы данных, совместимый с системой AITS, с лазерной маркировкой на всех инструментах
• Документ с характеристиками инструмента сопровождает каждую партию инструмента
• Узлы HPX® и HP2 имеют механически закрепленную функцию удержания направляющих, которая обеспечивает фиксацию инструмента в собранном состоянии во время загрузки

• Станция HPX® A и B
• Метрический стиль HP2 (станции A и B)
• Метрическая система HP (станции C, D и E)
• Wilson HP Style (станции C, D и E)
• HP DuraBlade® (Станция D & E)

ПРИМЕЧАНИЕ. Этот продукт можно приобрести только в офисе White Bear Lake, штат Миннесота, США.

Wilson Tool International предлагает самый широкий в отрасли набор стандартных инструментов для штамповочного пресса практически для любого применения с толстой револьверной головкой. Благодаря нашей новаторской технологии EXP® , доступной линии Basix , высокопроизводительному HP Dura Blade ® и увеличивающейся емкости Multi-Tools у нас есть решение практически для любого приложения.

Мы понимаем, что каждый магазин уникален, и наш спектр решений отражает это. Стандартная линия толстых револьверных головок позволяет создавать узлы малых и больших станций в традиционных формах и в неограниченном количестве нестандартных форм.Выберите метрическую систему или стиль Вильсона; Особенности сборки Basix, HP2 или HPX; Опции для тяжелых условий эксплуатации и многое другое.

Просмотрите многофункциональный инструмент , чтобы увеличить мощность револьверной головки, или решение для отрезки для оптимизации задач отрезки. Выберите линейку инструментов iSeries с толстой револьверной головкой для полной интеграции с системами идентификации инструмента AITS®.

Ознакомьтесь со всеми стандартными вариантами оснастки для толстой револьверной головки ниже. Чтобы ознакомиться с решениями для специальных применений или инструментов для формования, ознакомьтесь с нашим разделом Thick Turret Specials .

Быстрое обнаружение инокулята Ceratocystis platani с помощью количественного анализа ПЦР в реальном времени

Резюме

Ceratocystis platani является возбудителем язвенного поражения платанов, смертельной болезни, способной убить зрелые деревья за один или два последовательных вегетационных сезона. Возбудитель является карантинным организмом и оказывает негативное влияние на антропогенные и естественные популяции платанов. Загрязненные опилки, образующиеся во время обрезки и санитарных рубок, могут способствовать распространению болезней.Целью этого исследования было разработать быстрый количественный ПЦР-анализ в реальном времени для обнаружения инокулята C. platani , переносимого по воздуху. Ловушки для переносимого по воздуху инокулята (AIT) были размещены в городских условиях во Флоренции, Италия, где присутствовала болезнь. Праймеры и зонды TaqMan для связывания малых бороздок (MGB) были разработаны для нацеливания на гены цератоплатанина (CP) и внутреннего транскрибированного спейсера 2 (ITS2). Пределы обнаружения анализа составляли 0,05 пг / мкл и 2 фг / мкл грибковой ДНК для CP и ITS, соответственно.Обнаружение патогенов непосредственно из AIT продемонстрировало специфичность и высокую чувствительность для C. platani , обнаруживая концентрации ДНК от 1,2 × 10 ^–2 до 1,4 × 10 ^–2 пг / мкл, что соответствует ~ 10 конидий на мл. Ловушки для инокулята, переносимого по воздуху, смогли обнаружить инокулят C. platani в пределах 200 м от ближайшего зараженного платана с симптомами. Комбинация воздушно-капельной ловушки и количественного анализа ПЦР в реальном времени обеспечивает быстрый и чувствительный метод специфического обнаружения C.platani инокулят. Этот метод можно использовать для определения периода наибольшего риска распространения патогена на участке, тем самым помогая контролировать заболевание.

ВВЕДЕНИЕ

За последние 20 лет были разработаны протоколы биобезопасности для защиты растений с целью предотвращения распространения инвазивных патогенов растений и содействия их искоренению (1). Большинство инвазивных чужеродных вредителей и патогенов, которые распространяются в новую среду, заносятся в результате коммерческой торговли растениями (2, 3, 4, 5).Контроль над этими патогенами чрезвычайно затруднен, когда присутствует фаза распространения по воздуху, что позволяет болезни распространяться в более широком масштабе (6).

В местном масштабе, в том числе в городских районах, способность обнаруживать инокулят, переносимый по воздуху, имеет решающее значение для понимания распространения болезней и борьбы с патогенами, вызывающими повреждение растений, такими как Ceratocystis platani (J. M. Walter) Engelbr. & T. C. Harr. (= Ceratocystis fimbriata Ellis & Halsted f. Sp. platani Walter), возбудитель пятен от язвы платанов.Этот гриб вызывает смертельную болезнь на Platanus × acerifolia (Aiton) Willd (лондонский самолет), Platanus orientalis L. (восточный план) и в меньшей степени на Platanus occidentalis L. (платан американский). на городских плантациях, плантациях для производства древесины и волокна, а также в естественных лесах как в Северной Америке, так и в Европе (7, 8, 9, 10).

В Северной Америке C. platani причинили значительный ущерб лондонским платанам в городских районах в 1930-е годы (7) и P.occidentalis в 1960-х (8) и 1990-х годах (9).

C. platani был завезен в Европу из юго-востока США, вероятно, на древесине, связанной с военными припасами во время Второй мировой войны (10). Первое подтверждение болезни было в Тоскане, Италия, в 1972 году (11), где патоген уже разрушил монументальный проспект, соединяющий Реджиа-ди-Казерта с Неаполем (12). В Европе патоген в настоящее время присутствует в Армении, Франции, Швейцарии (13) и Греции (14), где он вызывает серьезные потери у естественных P.orientalis популяций. Из-за сильного воздействия на платаны C. platani считается карантинным организмом Европейской и Средиземноморской организацией защиты растений (ЕОКЗР) (15).

Грибок представляет собой раневой паразит, который колонизирует ткани ксилемы и убивает дерево в течение нескольких лет после заражения (16). C. platani естественным образом передается через корневой анастомоз, зараженную воду и, как предполагают результаты недавних исследований, через ассоциацию с жуками-амброзиями (14, 17).Тем не менее, наиболее важными средствами распространения, особенно в городских районах, являются загрязненные опилки и оборудование, используемое для санитарных рубок (7). В этом контексте мониторинг посевного материала может привести к лучшему пониманию динамики распространения по воздуху в окружающей среде.

В последние годы было разработано несколько методов улавливания переносимого по воздуху инокулята инвазивных лесных патогенов из проб окружающей среды. Древесные диски использовались для улавливания конидий Heterobasidion irregulare на сосновых плантациях (18, 19), а бумажные фильтры использовались для улавливания инокулята Fusarium circinatum на участках, инфицированных язвой сосновой смолы (20).Использование надежных методов улавливания в сочетании с чувствительными молекулярными подходами, такими как количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР), позволяет быстро и точно определять грибковые патогены в этих образцах (21). Появление этого молекулярного метода позволило использовать более быстрые и чувствительные диагностические инструменты для идентификации и количественной оценки болезнетворных агентов. Точность и надежность КПЦР также может позволить обнаруживать скрытые грибковые инфекции до появления симптомов (22, 23) и обнаруживать грибковые патогены, которые трудно культивировать (21).

Целью описанной здесь работы была разработка точного и воспроизводимого метода обнаружения C. platani в пробах из окружающей среды с использованием анализа qPCR. Затем этот молекулярный подход был использован для изучения мелкомасштабной эпидемиологии этого патогена и оценки распространения инокулята во время санитарных рубок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изоляты грибов, выделение ДНК и филогенетический анализ.

Штаммы Ceratocystis platani , использованные в этом исследовании (), были получены из Центрального бюро по шиммелкальтурам (CBS, Нидерланды) и из коллекций Istituto per la Protezione delle Piante-Consiglio Nazionale delle Ricerche (IPP-CNR, Италия). .Изоляты грибов выращивали на целлофановых дисках 300PT (Celsa, Varese, Италия) на картофельном агаре с декстрозой (PDA; Difco Laboratories, Детройт, Мичиган) в чашках Петри диаметром 90 мм и инкубировали в темноте при 20 ° C. Через 7 дней мицелий соскребали с поверхности целлофана и хранили в 1,5-мл микроцентрифужных пробирках (Sarstedt, Верона, Италия) при -20 ° C. Экстракцию ДНК проводили из мицелия с использованием прибора E.Z.N.A. мини-набор ДНК растений (Omega Bio-tek, Norcross, GA) в соответствии с инструкциями производителя.Концентрацию экстрагированной ДНК измеряли с помощью спектрофотометра Nanodrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Для выяснения филогенетических отношений между C. platani и другими видами Ceratocystis () и для проверки специфичности анализа qPCR, выравнивание последовательностей внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS), β-тубулина и цератоплатанина. (CP) гены. Цератоплатанин — небольшой гидрофобный белок из C. platani (24).Область ITS2 амплифицировали с помощью общих праймеров ITS1 и ITS4 согласно White et al. (25), тогда как ген β-тубулина амплифицировали с использованием праймеров Bt2a и Bt2b, как описано Glass и Donaldson (26). Цератоплатанин амплифицировали с набором праймеров CeraF (5′-ATGAAGTTCTCTATCCTACCC-3 ‘) и CeraR (5′-AGGAGCTTCCGGAGAAGTCAC-3’) (это исследование) со следующими условиями цикла: начальная денатурация 95 ° C в течение 2 минут, затем на 40 циклов при 94 ° C в течение 30 с, 55 ° C в течение 45 секунд и 72 ° C в течение 90 секунд с заключительной стадией удлинения при 72 ° C в течение 9 минут.Продукты ПЦР очищали и секвенировали непосредственно с использованием набора для готовых реакций секвенирования цикла терминатора BigDye197 (Applied Biosystems, Foster City, CA) и анализировали с помощью 48-капиллярного секвенатора ДНК ABI-3130xl (Applied Biosystems). Филогенетические деревья максимального правдоподобия (ML) были построены для ITS и для конкатенированных последовательностей β-тубулина и CP с использованием программы RAxML (27) с моделью GTR (28, 29). Значения начальной загрузки оценивались на основе 1000 повторов. Расчеты проводились в Витал-ИТ Центре (http: // www.vital-it.ch) для высокопроизводительных вычислений Швейцарского института биоинформатики (SIB). Petrellia setifera ({«type»: «entrez-nucleotide», «attrs»: {«text»: «AF043596», «term_id»: «2865497», «term_text»: «AF043596»}} AF043596) от Witthuhn и другие. (30) использовалась как внешняя группа для ITS-дерева, а Ceratocystis albifundus ({«type»: «entrez-nucleotide», «attrs»: {«text»: «EU244986», «term_id»: «167380363» , «term_text»: «EU244986»}} EU244986) от Heath et al. (31) использовалась как внешняя группа для конкатенированного дерева.

Таблица 1

Изоляты грибов, использованные в этом исследовании

Условия анализа qPCR.

25 мкл смеси для ПЦР, содержащей 12,5 мкл мастер-микса TaqMan Universal (Applied Biosystems), проводили на детекторе последовательностей ABI Prism 7300 (Applied Biosystems). Конечные концентрации праймера и зонда были следующими: прямой праймер 300 нМ (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Германия), 300 нМ обратный праймер (Eurofins MWG Operon) и зонд TaqMan MGB 200 нМ (Applied Biosystems), предназначенный для амплификации ITS. и гены CP. Для каждой пробирки использовали 5 мкл образца ДНК.

Все образцы ДНК анализировали в оптических 96-луночных планшетах MicroAmp (Applied Biosystems), закрытых оптическими колпачками MicroAmp, с использованием детектора последовательности ABI Prism 7300 (Applied Biosystems).Каждый образец ДНК анализировали в трех повторностях. Четыре лунки, каждая из которых содержала 5 мкл стерильной воды, использовали в качестве контроля без матрицы (NTC). Протокол ПЦР: 50 ° C (2 мин), 95 ° C (10 мин), 50 циклов при 95 ° C (30 с) и 60 ° C (1 мин).

Результаты были проанализированы с использованием системы обнаружения последовательности SDS 1.9 (Applied Biosystems) после ручной корректировки исходного уровня и порога флуоресценции. Измерения ДНК C. platani в неизвестных образцах были выполнены путем интерполяции стандартной кривой, построенной с помощью C.platani , который амплифицировали в том же цикле ПЦР. Стандартная кривая была построена из 5-кратных серийных разведений (в диапазоне от 100 нг / пробирка до 0,25 пг / пробирка) известной концентрации C. platani ДНК (штамм Cp5) и проанализирована в трех повторностях в семи независимых анализах. Количество ДНК C. platani выражали в пг / мкл.

МТА.

Эффективность системы улавливания инокулята в воздухе (AIT) оценивалась путем инокуляции фильтровальной бумаги Whatman конидиальной суспензией C.platani с последующим молекулярным обнаружением. AIT были приготовлены с использованием чашек Петри диаметром 90 мм (Sarstedt, Верона, Италия), содержащих ватман No. 1 фильтровальная бумага (Sigma-Aldrich, Милан, Италия), смоченная 4 × TE буфером (40 мМ Tris HCl, 4 мМ EDTA [pH 8,0]) (20). Каждую чашку Петри прикрепляли к основанию небольшого алюминиевого лотка (500 мл) с помощью двусторонней липкой ленты. Поднос закрывали пластиковой сеткой (размер ячеек 6 на 6 мм). Суспензию конидий (1 мл в стерильной воде) получали при температуре ° С.platani изолят CF0 () после инкубации на 1,5% PDA в течение 10 дней. Количество конидий определяли в камере Беркера и готовили пять серийных разведений 1:10 в диапазоне от 10 до 10 ⁵ конидий / мл. Для каждого конидиального разведения осадок получали после центрифугирования при 16100 × g в течение 5 мин и использовали для экстракции ДНК. Два ватмана нет. 1 фильтровальную бумагу засевали каждым из разведений конидий. Затем фильтры промывали в центрифужной пробирке на 50 мл (Sarstedt), содержащей 20 мл буфера ТЕ (4 ×) при 65 ° C.Каждую пробирку центрифугировали при 289 × g в течение 90 мин для осаждения осадка. Затем один миллилитр суспензии, содержащей осадок и TE-буфер, переносили в 2-миллилитровую микроцентрифужную пробирку (Sarstedt) и после центрифугирования при 16100 × g в течение 5 минут осадок использовали для экстракции ДНК с использованием E.Z.N.A. набор ДНК растений, как описано ранее. Как ДНК из конидиальной суспензии, так и инокулированная фильтровальная бумага тестировали с помощью КПЦР, как описано выше.

Экологическое исследование было проведено в октябре 2011 года на уличных платанах во Флоренции, Италия (43 ° 47′59 ″ с.ш., 11 ° 13′94 ″ в.д., 51 м над уровнем моря) для оценки наличия C Инокулят platani в городских условиях с использованием АИТ. Присутствие патогена определяли в двух областях отбора проб: (i) зараженная область с Platanus × acerifolia , показывающая симптомы пятен язвы, и (ii) окружающая область со здоровыми платанами.Отбор проб производился на участках не менее 50 м друг от друга. В зоне заражения была запланирована санитарная вырубка для удаления зараженных платанов. Присутствие C. platani в зоне инфекции на симптоматических плоскостях было подтверждено выделением на КПК (33). Вкратце, выделения проводились из образцов, взятых на границе между некротическими и здоровыми тканями. Небольшие фрагменты собирали с края некротизированной ткани и помещали в чашки Петри диаметром 90 мм на 1.5% КПК и инкубировали при 20 ° C в течение 10 дней. Кроме того, ДНК экстрагировали как из некротических, так и из здоровых тканей и анализировали с помощью КПЦР, как описано выше. Всего было изготовлено 25 АИТ: 11 размещены на зараженном участке, а остальные 14 размещены на прилегающей территории. Каждый АИТ размещался на высоте 2 м над уровнем почвы на расстоянии 10 м друг от друга на каждом фонаре. В окрестностях за 7 дней до санитарных рубок устанавливали ловушки и ежедневно смачивали 5 мл 4-кратного TE-буфера (pH 8.0) на фильтр. Чтобы избежать заражения ловушек C. platani перед началом рубок, ловушки были помещены в очаг заражения ранним утром и сняты в тот же день после завершения рубок. AIT были доставлены в лабораторию, ДНК была извлечена из фильтров, как описано выше, и была проведена количественная ПЦР для определения присутствия C. platani .

Тесты на патогенность.

Для оценки минимального количества C. platani , способного вызвать повреждение платанов, были проведены испытания инокуляции на 18 5-летних горшечных рамах Platanus × acerifolia , полученных путем укоренения черенков отдельного самолета. дерево.(Раметы — это вегетативно воспроизводимые копии растения; каждый рамет имеет тот же генотип, что и исходное родительское дерево.) Инокуляцию проводили в мае 2012 года путем ранения на 40 см над почвой (диаметр стебля 1 см), по одной ранке на каждое растение. , используя лезвие ножа с каплей 0,2 мл пяти последовательных разведений 1:10, ранее использовавшихся для прививок AIT (конидиальные концентрации в диапазоне от 10 до 10 ⁵ конидий / мл). Были инокулированы три крысы для каждой конидиальной концентрации, и три раненых неинокулированных крыла использовали в качестве контрольных растений.Раметы были завернуты в парафильм в местах посева для уменьшения загрязнения и предотвращения чрезмерного высыхания. Через 4 месяца было обнаружено C. platani по наличию специфических симптомов и повторному выделению мицелия из инокулированной плоской ткани на КПК (33).

Анализ данных.

Эффективность ПЦР рассчитывалась по наклону стандартной кривой: эффективность = 10 ^{(-1 / наклон)} -1 (34). Воспроизводимость анализа кПЦР оценивали путем вычисления коэффициента вариации (% CV) среди средних значений в семи независимых анализах.Пороговое значение составляло 0,15, и исходная эмиссия была рассчитана для циклов с 3 по 15. Точность AIT в перехвате воздушного инокулята C. platani при различных конидиальных концентрациях была проверена путем количественного определения области ITS с помощью qPCR с ДНК экстрагировали из большой серии разведений грибковых конидий, полученных либо из засеянной фильтровальной бумаги Whatman, либо непосредственно из дистиллированной воды. Экспоненциальная функция log-log в форме y = a + be ^x была приспособлена к данным для описания взаимосвязи между конидиальным разведением ( x ) и количеством грибковой ДНК ( y ) в обоих типах выборок, и сравнивались оценки параметров.Сравнение моделей включало проверку гипотезы о том, что оба набора данных (экстракция из конидий в воде или из конидий на фильтровальной бумаге Whatman) имеют одну и ту же кривую. Оценки параметров, полученные путем раздельного применения модели к двум наборам данных, были протестированы (тест F ) по сравнению с оценками, полученными путем глобального подбора одной и той же модели к обоим наборам данных. Факторный дисперсионный анализ (ANOVA) (взаимодействие типа субстрата × конидиальная концентрация) применяли для дальнейшего тестирования различий между двумя методами.Логит-модель (обобщенная линейная модель [GLZ]) применялась для проверки диффузии инокулята (как его наличия, так и количества) в зависимости от расстояния от ближайшего симптоматического дерева и количества симптоматических деревьев в окрестностях ловушки. Взаимосвязь между присутствием или отсутствием или количеством инокулята в AIT и расстоянием от симптоматических деревьев описывалась путем подбора обратной экспоненциальной модели, показанной уравнением ( y = a + be ^x ) к этим данным.GLZ-анализ, нелинейная оценка (процедура аппроксимации кривой наименьших квадратов, алгоритм Левенберга-Марквардта) и ANOVA выполнялись в Statistica 6.0 (35).

Номера доступа нуклеотидных последовательностей.

Вновь определенные последовательности (для последовательностей ДНК ITS1-5.8S-ITS2, CP и β-тубулина) депонированы в GenBank под номерами доступа {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text» : «KC493159», «term_id»: «510794567», «term_text»: «KC493159»}} KC493159 на {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «KC493171», «term_id» «:» 510794579 «,» term_text «:» KC493171 «}} KC493171, {» type «:» entrez-нуклеотид «,» attrs «: {» text «:» KF302676 «,» term_id «:» 523408207 «,» term_text «:» KF302676 «}} KF302676 в {» type «:» entrez-нуклеотид «,» attrs «: {» text «:» KF302687 «,» term_id «:» 523408229 «,» term_text «:» KF302687 «} } KF302687 и {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «KF302688», «term_id»: «523408175», «term_text»: «KF302688»}} KF302688 для {«type «:» entrez-nucleotide «,» attrs «: {» text «:» KF302703 «,» term_id «:» 523408205 «,» term_text «:» KF302703 «}} KF302703 (подробнее см. Таблицу S1 в дополнительном материал).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Филогенетический анализ изолятов

Филогенетическая топология, реконструированная с помощью ITS-последовательностей и конкатенированных последовательностей β-тубулина и CP, показала, что C. platani встречается в основном кластере изолятов C. fimbriata (см. Рис. S2 и S3 в дополнительном материале). . Классификация Ceratocystis cacaofunesta в одном кластере подтвердила тесную филогенетическую связь между этими штаммами.Напротив, C. variospora и C. populicola дифференцировались в отдельную кладу (см. Рис. S2 и S3).

Зонды TaqMan MGB и специфичность праймеров.

Для каждого гена-мишени (ITS и CP) положения вышестоящего праймера, обратного праймера и внутреннего зонда показаны в. Общая длина ампликонов составляла 55 п.н. и 59 п.н. для генов-мишеней ITS и CP соответственно. Характеристики праймеров и зонда приведены в. Нуклеотид-нуклеотидный поиск BLAST показал полную гомологию (100%) между последовательностью CP-ампликона, разработанной как для C.platani гены-мишени (CP и ITS). Только изолятов C. platani были положительно амплифицированы с помощью кПЦР на ДНК грибов с использованием обеих комбинаций праймер-зонд, разработанных для мультикопийных (ITS) и однокопийных (CP) генов. ДНК из изолятов других видов Ceratocystis и грибов других родов не амплифицировались ().

Выравнивание двух праймеров и последовательностей зонда TaqMan MGB против внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) и гена цератоплатанина (CP), для которых был разработан анализ.Последовательности праймеров указаны прямоугольниками со стрелками, а последовательности зондов показаны заштрихованными прямоугольниками. Эталонные последовательности Ceratocystis platani были {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «EU426554», «term_id»: «183013710», «term_text»: «EU426554»}} EU426554. для ITS и {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «EF017218», «term_id»: «121624689», «term_text»: «EF017218»}} EF017218 для CP. Последовательности C. cacaofunesta (CBS15362), C. fimbriata (114723), C.populicola (115161) и C. variospora (114719).

Таблица 2

Праймеры и зонды, разработанные для Ceratocystis platani с использованием программного обеспечения Primer Express 3.0

Таблица 3

Анализы ПЦР в реальном времени для обнаружения Ceratocystis platani из ткани мицелия, AITatan и из мицелия, AITatan и гены-мишени CP

%) положительных образцов

Воспроизводимость и чувствительность анализа кПЦР.

Качество стандартных кривых оценивали путем сравнения пороговых значений цикла ( C _T ) для каждой точки кривой, поскольку каждое значение гипотетически должно быть одинаковым в повторных пробах, прогоняемых в одинаковых условиях. Наблюдались различия между стандартными кривыми, построенными с использованием генов CP и ITS (,). Однако воспроизводимость стандартных кривых была высокой, поскольку коэффициент вариации для каждой точки был ниже 5% для обоих генов-мишеней C. platani ().Для каждого гена-мишени измерения линейности, такие как наклон, пересечение и и коэффициент корреляции ( r ² ), существенно не различались между семью анализами (% CV <2%). Сравнение двух комбинаций праймер-зонд CP и ITS показало различия в чувствительности: значения C _T молекулярных маркеров, разработанных для гена CP, были выше, чем значения, полученные для генов ITS (). Разница (Δ C _T ) между этими двумя генами-мишенями составила 6.22 ± 0,2 (среднее ± стандартное отклонение [SD]). Пределы обнаружения анализа кПЦР составляли 0,05 пг / мкл и 2 фг / мкл ДНК для комбинаций праймер-зонд CP и ITS, соответственно. Из-за более высокой чувствительности наборы комбинаций праймер-зонд ITS были впоследствии использованы для обнаружения и количественного определения C. platani из проб окружающей среды AIT.

Таблица 4

Воспроизводимость стандартных кривых ITS и CP

Графики амплификации ДНК Ceratocystis platani , демонстрирующие сравнение двух различных зондов TaqMan MGB. Флуоресценция (нормализованный репортерный сигнал, Rn) зондов TaqMan MGB для целевого гена CP (пунктирная линия) появляется позже, чем флуоресценция зонда, предназначенного для области ITS (сплошные линии). Для каждого гена-мишени проводили семь различных серийных разведений 1: 5 (в диапазоне от 100 нг до 0,25 пг / пробирку) ДНК Cp5 штамма C. platani .На вставке показаны стандартные кривые для абсолютного количественного определения C. platani с использованием зондов TaqMan MGB, разработанных на основе (i) гена CP (пунктирная линия) и (ii) области ITS (непрерывная линия). Стандартные кривые были построены путем нанесения чисел порогового цикла ( C _T ) в зависимости от логарифмической концентрации геномной ДНК для каждой серии разведений.

Обнаружение

Изоляты C. platani (Cp3, Cp5, Cp6, Cp8 и Cp9) (), полученные из симптоматических плоских деревьев, были идентифицированы на основе морфологических характеристик и с помощью количественной ПЦР, протестированной на ДНК, выделенной из мицелия.

КПЦР также использовался для идентификации и количественной оценки C. platani в ДНК, выделенной из тканей симптоматической плоскости (). Количество C. platani ДНК, обнаруженное в этих образцах с использованием как праймера, так и зондов (наборы для CP и ITS), находилось в диапазоне от 2,0 × 10 ³ до 5,0 × 10 ³ пг ДНК на мкг общей экстрагированной ДНК. C. platani ДНК отсутствовала в бессимптомных тканях плоскости, используемых в качестве отрицательного контроля (). Отобранные графики амплификации ПЦР, полученные из тестируемых образцов, показаны на.

Обнаружение Ceratocystis platani зондом TaqMan MGB на ITS2. Выбор графиков амплификации из различных образцов ДНК: (i) мицелий C. platani и инфицированные плоские ткани (непрерывные линии), (ii) ловушки для инокулята, переносимые по воздуху (AIT) из области отбора образцов (пунктирные линии с точками), и C. platani конидиальная подвеска (пунктирные линии с длинными сегментами). Флуоресцентный сигнал (нормализованный репортерный сигнал, Rn) отсутствовал в контроле без матрицы (NTC), у других видов Ceratocystis и других грибов, а также в ткани здоровой плоскости (горизонтальная пунктирная линия).

При использовании комбинации праймер-зонд ITS количество C. platani ДНК, присутствующей в конидиальных суспензиях, составляло от 0,5 × 10 ^-2 до 1,8 × 10 ² пг / мкл общей ДНК (от ~ 10 до 10 ⁵ конидий / мл соответственно). Обнаружение патогена из AIT различается в зависимости от используемого молекулярного маркера. Когда использовалась комбинация ITS-праймер-зонд, все 11 AIT из места заражения включали C. platani , тогда как 4 из 14 были положительными в окружающей области.Количество грибковой ДНК на этих AIT составляло от 1,2 × 10 ^-2 до 5,3 пг / мкл. Напротив, комбинация CP-праймер-зонд дала положительные результаты только для 3 из 11 AIT из инфицированного сайта, в то время как ловушки, расположенные из окружающей области, были отрицательными. Количество ДНК C. platani находилось в диапазоне от 4,5 × 10 ^-2 до 1,1 пг / мкл.

За исключением самой высокой концентрации конидий C. platani , количество полученной ДНК не варьировалось между субстратами экстракции, т.е.е., конидиальные суспензии в воде или суспензии, нанесенные на фильтровальную бумагу (ANOVA, значительное взаимодействие субстрат × концентрация, P <0,001; действительно значимая разница [HSD] post hoc test, P > 0,1). При 10 ⁵ конидий на мл значительно большее количество ДНК было получено из суспензии конидий в воде (тест HSD post hoc , P <0,001), чем из AIT. Взаимосвязь между конидиальным разведением ( x ) и количеством C.platani ДНК, обнаруженная с помощью кПЦР с использованием комбинации праймер-зонд ITS ( y ), давала экспоненциальную кривую (как показано в уравнении: y = a + будет ^x ). Кривые, полученные при подгонке модели к количеству ДНК, полученной из засеянной фильтровальной бумаги ( y = -3,97 + 0,078 e ^x ) и из конидиальных суспензий в воде ( y = -4,22 + 0,093 e ^x ) были похожи ().Оценки для a и b в уравнении y = a + be ^x имели перекрывающиеся доверительные интервалы (, вставка) и существенно не различались между двумя кривыми ( a F Значение = 0,41; P = 0,532; b Значение F = 4,21, P = 0,063).

Обнаружение Ceratocystis platani в ватмане № 1 фильтровальная бумага, искусственно инокулированная конидиальными суспензиями.Количество C. platani ДНК, обнаруженное с помощью ПЦР в реальном времени для ITS-области, было связано с конидиальным разведением. Нелинейная регрессия ( y = a + be ^x ) была подогнана к данным, преобразованным в натуральный логарифм (ln), где x = ln (конидиальное разведение) и y = ln. (общая ДНК), выделенная из конидий. Результаты, полученные для конидиальных суспензий, нанесенных на фильтровальную бумагу Whatman (светлые символы и пунктирная линия; y = -3.97 + 0,078 e ^x ) или из конидиальных суспензий в дистиллированной воде (закрашенные символы и сплошная линия; y = -4,22 + 0,093 e ^x ). На вкладках приведены оценки значений параметров ( a и b ) ± 95% доверительный интервал.

C. platani был обнаружен в АИТ в пределах 200 м от ближайшего дерева симптомов. По сравнению с отрицательными AIT, положительные AIT были окружены большим количеством симптоматических деревьев в радиусе 100 м и были значительно ближе к зараженным деревьям.Частота положительных АИТ ( F _S ) значительно увеличивалась с увеличением количества симптоматических деревьев ( N _ST ), расположенных в радиусе 100 м (), и снижалась с увеличением расстояния ( D ) от ближайшее симптоматическое дерево (). Логит-регрессия показала, что как N _ST [χ ² ₍₁₎ = 8,26, P = 0,004], так и D [χ ² ₍₁₎ = 10,33, P = 0.001] оказали значительное влияние на обнаружение грибка на AIT. Зависимость успешного обнаружения от D описывалась обратной экспоненциальной функцией в виде F _S = a + e ^bD () ( a = 1,002, b = 0,008 , P ≤ 0,05; объясненная дисперсия = 81,6%). Подобная кривая эффективно описывает уменьшение количества ДНК ( Q _ДНК ) C.platani , полученный из AIT, когда расстояние между ловушкой и ближайшим симптоматическим деревом увеличилось () ( Q _ДНК = a + e ^bD ; a = 4.612, b = 0,016, P ≤ 0,05; объясненная дисперсия = 95,3%).

Распространение по воздуху инокулята Ceratocystis platani во время санитарных рубок. Показаны вариации (A) количества симптоматических деревьев в пределах 100-метрового расстояния и (B) расстояния от ближайшего симптоматического дерева в отрицательных или положительных ловушках для переносимого по воздуху инокулята (AIT) для обнаружения C.platani . Горизонтальная линия в каждом поле — среднее значение; прямоугольник представляет стандартную ошибку, а усы указывает стандартное отклонение. Открытые кружки и звездочки указывают выбросы и крайности соответственно. (C и D) Снижение частоты перехвата патогенов на AIT (успешное обнаружение) (C) и уменьшение количества ДНК C. platani (D) как обратные экспоненциальные функции расстояния до ближайшего дерева симптомов.

Тесты на патогенность.

Через 4 месяца все рамы, зараженные конидиальной концентрацией от 10 ² до 10 ⁵ конидий / мл, погибли. Эти растения демонстрировали типичные симптомы язвы с синими пятнами, состоящую из язв на стеблях вокруг места заражения и обесцвечивания древесины. Выделение на среде PDA показало присутствие грибкового мицелия, идентифицированного как C. platani . Никаких симптомов не наблюдалось, и невозможно было успешно выделить патоген из контрольных растений и из растений, инокулированных 10 конидиями / мл.

ОБСУЖДЕНИЕ

Представленная здесь работа продемонстрировала использование чувствительного и надежного метода для обнаружения и количественной оценки переносимого по воздуху инокулята C. platani , участвующего в распространении патогенов. Этот метод сочетает в себе простой и экономичный метод улавливания с молекулярным подходом, основанным на анализе количественной ПЦР.

Применение метода количественной ПЦР в сочетании с эффективными методами улавливания инокулята позволило идентифицировать и количественно определить патоген с воздуха. Извлечение ДНК непосредственно из фильтров устраняет необходимость в трудоемкой микроскопии и культивировании и позволяет напрямую обнаруживать целевые микроорганизмы.Интеграция методов отбора проб из воздуха и молекулярной диагностики позволила получить чувствительные, специфические и количественные данные для нескольких патогенов (21). Использование КПЦР для молекулярной диагностики привлекательно из-за высокой чувствительности и пропускной способности (36, 37). Более того, этот подход позволяет обнаруживать и количественно определять очень небольшие количества грибковой ДНК и, следовательно, является мощным инструментом для раннего наблюдения и обнаружения грибковых патогенов в здоровой растительной ткани до проявления симптомов у хозяина (22, 23).

Большинство сообщений об обнаружении переносимых по воздуху микроорганизмов методом количественной ПЦР поступают из клинической микробиологии (21). Однако количественная ПЦР также использовалась для количественного определения переносимого по воздуху инокулята грибковых патогенов, таких как Sclerotinia sclerotiorum , Leptosphaeria spp., Puccinia striiformis и Botrytis squamosa (38, 39, 40, 41), которые вызывают серьезные заболевания пахотных культур, а также возбудителя лесных деревьев Fusarium circinatum (20, 42).

Многие грибковые заболевания инициируются переносимым по воздуху инокулятом, который попадает на восприимчивых хозяев при благоприятных условиях окружающей среды. Ceratocystis platani представляет значительную угрозу, особенно в городских районах, поскольку он может заразить здоровые платаны, когда во время санитарной обрезки и рубок инокулят может быть перенесен ветром на свежие раны, которые иногда присутствуют на окружающих деревьях (16). По этой причине, среди прочего, обнаружение инокулята C. platani важно для улучшения понимания механизмов и динамики распространения патогенов.

В этом исследовании набор комбинаций праймер-зонд CP и ITS может точно определить C.platani из культивируемых изолятов и не показали перекрестной реактивности с другими филогенетически родственными видами Ceratocystis . Молекулярные маркеры, разработанные здесь, были специфичными и не амплифицировали ДНК обычных переносимых по воздуху грибов, таких как Alternaria sp., Cladosporium sp. Или Epicoccum (43), которые встречаются в городских районах и у других видов. платанами, такими как Microsphaera platani (44) и Sarchodontia pachyodon (45).Для сбора переносимых по воздуху спор использовалось несколько методов, но идентификация различных видов грибов обычно основывалась на использовании традиционных методов, таких как микроскопия или культивирование на искусственных средах (21). Эти методы занимают много времени и требуют высокого уровня знаний для точной идентификации организмов, особенно если разные виды грибов имеют схожую морфологию спор. Кроме того, для C. platani переносимый по воздуху инокулят также представлен инфицированными опилками и древесными остатками, которые распространяются в окружающей среде во время санитарных операций (7).

Системы обнаружения, доступные для кПЦР, также могут быть неспецифическими, если интеркалирующие красители (например, краситель SYBR green I) создают флуоресцентное связывание с фрагментами ПЦР (46). В этой работе анализ qPCR был основан на зондах TaqMan для связывания малых бороздок (MGB), которые включают 5′-репортерный краситель и 3′-нефлуоресцентный тушитель (NFQ). NFQ предлагает преимущество более низкого фонового сигнала, что приводит к большей точности количественного определения, стабилизации гибридизации зонда с одноцепочечными ДНК-мишенями и приводит к улучшенной специфичности по сравнению с обычными зондами TaqMan (47).

Однако наблюдались разные результаты с точки зрения чувствительности при использовании разных маркерных генов, созданных на основе областей CP или ITS. Хотя оба набора праймер-зонд были специфичными для C. platani , наблюдались различия в чувствительности к патогенам. Наши результаты соответствуют результатам, полученным для Aspergillus fumigatus , где было обнаружено ~ 5-кратное различие в C _T между геном FKS1, используемым в качестве однокопийного контрольного гена, против мультикопийного гена рРНК 18S. (48).Сравнимые различия (6-кратные) были также обнаружены с F. circinatum в сравнении между многокопийным рибосомным геном IGS и однокопийными генами типа спаривания (20). Эти результаты подчеркивают преимущество использования мультикопийного гена рибосомальной ДНК (рДНК), поскольку амплификация целевого гена может быть в 10-100 раз более чувствительной, чем амплификация однокопийных генов (49, 50).

Хотя однокопийный ген CP представляет собой конкретную мишень для C. platani , чувствительность разработанной здесь комбинации праймер-зонд была очень низкой, и ее использование для обнаружения грибка в образцах окружающей среды может привести к недооценке количества переносимых по воздуху посевной материал.

Наблюдаемые нами различия между генами с одной и несколькими копиями отражают различия в пределах обнаружения анализа кПЦР, который обнаружил 0,05 пг и 2 фг C. platani ДНК / мкл для CP и ITS, соответственно. Эти значения намного ниже, чем для F. circinatum , найденные Schweigkofler et al. (20), которые использовали анализ qPCR на основе химии SYBR green. Причины этих различий неизвестны. Хотя экстракция ДНК проводилась из фильтровальной бумаги Whatman, различия в количественном определении ДНК можно объяснить несколькими другими факторами — например, методами экстракции ДНК, а также менее чувствительной химией КПЦР (SYBR зеленый по сравнению с TaqMan) (46).

В настоящее время идентификация C. platani в основном основана на визуальном осмотре симптомов с последующим выделением в лаборатории среды для подтверждения (15). Метод ловушки был описан ранее для изоляции C. platani из почвы и зараженной древесины (51). Серологический анализ также был оптимизирован для подтверждения присутствия белка CP из аскоспор и мицелия C. platani (52), но он никогда не использовался в диагностических целях.Ранее сообщалось о молекулярном подходе, основанном на кПЦР, для обнаружения C. platani из искусственно и естественно зараженной древесины платана (53). Однако метод количественной ПЦР, описанный в этом исследовании, более чувствителен. Предел обнаружения описанного здесь анализа, 2 фг ДНК C. platani / мкл, был ниже, чем тот, который сообщается Pilotti et al., 10 фг / мкл (53).

Анализ qPCR, протестированный в настоящей статье, был успешно использован для обнаружения C. platani непосредственно из естественно инфицированных тканей плоскости, что делает его полезным инструментом для диагностики окрашивания плоскости рака.Однако в отличие от Pilotti et al. (53), основная цель этого исследования заключалась в оптимизации анализа количественной ПЦР, способного обнаруживать и количественно определять даже небольшие количества переносимой по воздуху ДНК C. platani . По этой причине были разработаны более короткие зонды, такие как зонд TaqMan MGB, обеспечивающий повышенную чувствительность и специфичность по сравнению с обычным зондом TaqMan (47) и обеспечивающий более эффективное обнаружение грибков.

В этой работе метод, использованный для перехвата инокулята, был аналогичен описанному Schweigkofler et al.(20). В этом исследовании самый низкий надежный предел обнаружения для конидиальных суспензий составлял ~ 10 конидий / мл (0,5 × 10 ^-2 пг C. platani ДНК / мкл), в то время как максимальное протестированное количество составляло 10 ⁵ конидий / мл. (180 пг C. platani ДНК / мкл). Следовательно, минимальное количество, обнаруженное в этом исследовании, было намного ниже, чем указано Schweigkofler et al. (20), которые смогли обнаружить минимум 10 ² конидий на 100 мкл (т.е. 10 ³ конидий на мл).Перехват и количественное определение инокулята C. platani также были эффективны для AIT, где минимальное количество грибковой ДНК составляло от 1,2 × 10 ^-2 до 1,4 × 10 ^-2 пг / мкл, что соответствует количеству обнаруженных пропагул около 10 конидий / мл.

Тесты на патогенность, проведенные в этом исследовании, показали, что минимальное количество грибкового инокулята, необходимое для возникновения заболевания, составляет 10 ² конидий / мл. Выше этих конидиальных концентраций все инокулированные растения проявляли симптомы язвенной болезни, вызывающей синюю окраску, что приводило к гибели растения.Эти концентрации даже ниже, чем те, о которых сообщил Vigouroux (54), который показал, что для развития устойчивых и воспроизводимых симптомов требуется минимум 200 спор C. platani на рану. Более того, эти результаты показали, что представленный здесь метод кПЦР позволяет обнаруживать более низкие концентрации посевного материала, чем те, которые могут вызвать заболевание. Таким образом, этот метод можно использовать для обнаружения скрытых инфекций патогена в бессимптомных вегетативных тканях или естественных насаждениях, улучшая раннее выявление болезни.Эта особенность имеет первостепенное значение для фитосанитарного контроля при торговле растениями, предотвращая или снижая риск распространения болезни.

Глобальная торговля растениями является основной причиной интродукции чужеродных видов, что способствует распространению вредителей и патогенов на большие расстояния (1, 3, 5). Однако распространение патогенов с участием человека также оказывает влияние на местном уровне, способствуя распространению патогенов в районах, где они ранее не были обнаружены. Этот процесс явился причиной распространения Fusarium oxysporum f.sp. canariensis , вызывающий летальное заболевание сосудов финиковых пальм Канарских островов ( Phoenix canariensis ) (55). Грибок может распространяться косвенно во время рубки зараженных растений, и в этом случае зараженные опилки распространялись на расстояние до 100 футов (около 30 м) (56).

C. platani , по-видимому, распространяется главным образом через инфицированные инструменты для обрезки и корневой анастомоз (16), хотя инокулят, переносимый по воздуху, включая споры, опилки и древесные остатки, представляет серьезный риск для открытых свежих ран здоровых платанов.В нашем исследовании мы обнаружили, что использование AIT позволило выявить переносимый по воздуху инокулят C. platani в пределах 200 м от ближайшего зараженного платана с симптомами. Кроме того, с помощью кПЦР удалось обнаружить присутствие C. platani из AIT в окрестностях здоровых платанов, ближайших к зараженному месту.

По этим причинам изучение механизмов распространения инокулята, переносимого по воздуху, важно для более глубокого понимания эпидемиологии этих патогенов.Более того, разработка высокоточных и надежных методов молекулярного обнаружения может помочь избежать вторжения в незагрязненные районы, повысив активность национальных организаций по защите растений (НОКЗР). Использование этих инструментов также оказалось полезным для сравнения распространения по Европе чужеродных патогенов, уже присутствующих в ограниченных зонах, как, например, в случае с C. platani . Жизненный цикл и распространение C. platani строго связаны с деятельностью человека.Для эффективного раннего надзора за этим патогеном и предотвращения его распространения в новые среды существует реальная потребность в быстром, простом и надежном методе обнаружения.