В соответствии с принципом реакции между бурой и HSYA и с учетом того, что на интенсивность флуоресценции HSYA сильно влияют pH и температура, влияние аниона и катиона. ограничено. В нейтральных условиях, низкой вязкости и отсутствии вмешательства Cu ²⁺ и I ^— , состояние приближено к внутренней среде организма, и затем предварительно устанавливается флуоресцентная сенсибилизация бура-HSYA.Ожидается, что в этом аналитическом методе сенсибилизирующая система будет применяться для изучения действия лекарственного средства in vivo .

Это исследование показало, что система сенсибилизации бура-HSYA почти не оказывала токсического действия на клетки рака мочевого пузыря T24 и мышей в пределах 100-кратной дозировки лекарства, эквивалентной нормальному внутривенному введению. Исходя из предположения о нетоксичности для клеток и организмов, система сенсибилизации не полагается на флуоресцентные молекулярные зонды или родственные флуоресцентные красители, но в определенной степени на основе собственной флуоресценции лекарств и может выполнять флюоресцентную визуализацию системы сенсибилизации. .Система сенсибилизации может быть дополнительно получена путем структурной модификации. Биофлуоресцентные препараты с высокой чувствительностью, нетоксичностью и хорошей биосовместимостью могут исследовать специфический механизм и метаболические пути лекарств и организмов с помощью флуоресценции лекарств и метаболизма лекарств.

Поскольку некоторые лекарственные препараты обладают флуоресценцией, но интенсивность флуоресценции мала, можно рассмотреть подходящую модификацию структуры лекарственного средства для получения желаемой структуры и свойств, и можно создать систему анализа сенсибилизации на основе конкретных свойств флуоресценции.Цель этого исследования — предоставить некоторые ссылки для лекарств с флуоресценцией, но со слабой интенсивностью флуоресценции для повышения интенсивности флуоресценции за счет системы сенсибилизации флуоресценции, а также для исследований метаболических путей лекарств и связанных с ними исследований и разработок новых лекарств.

Доступность данных

Данные, проанализированные для этого исследования, доступны у соответствующего автора по разумному запросу.

Раскрытие информации

CAO Haiyan является первым автором, а QIN Xiude — соавтором.

Конфликт интересов

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Вклад авторов

CAO Haiyan и QIN Xiude в равной степени внесли свой вклад в эту работу, провели эксперименты и составили рукопись. CAO Haiyan разработал концепцию, спланировал и разработал исследование. LIU Chen, ZHAO Xinzhe, MA Yuhui и LIU Yu подготовили и завершили рукопись. ZHOU Jingna и GE Shaoqin оказали помощь в анализе данных. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

Выражение признательности

Мы благодарим Zhejiang Yongning Pharmaceutical Co., Ltd. за предоставление данных масс-спектра и данных о ядерном магнитном поле гидроксизафлора желтого A. Исследование финансировалось Шэньчжэньским комитетом по науке и технологиям (№ JCYJ20180302173504891) и отделом здравоохранения и здравоохранения. Комиссия по планированию семьи провинции Хэбэй (№ 201

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы, содержащие масс-спектр и спектр ЯМР соединения HSYA. (Дополнительные материалы)

Сенсибилизация, зависящая от времени: одиссея научной ереси от лаборатории до дверей клиники

В 1980 году в статьях, опубликованных в журналах Nature и Science , эта лаборатория выразила ересь что, возможно, нет необходимости назначать лечение антидепрессантами в соответствии с обычным режимом, несколько раз в день. ^{4, 5} Вместо этого было высказано предположение, что характерная задержка терапевтического действия этих агентов на несколько недель была вызвана биологическими изменениями, происходящими с течением времени после острого лечения, а не фармакокинетическими факторами, и поэтому лекарства можно было принимать однократно. каждую неделю или две, и при этом они будут такими же эффективными, как при хроническом введении. Это смелое предложение было основано на результатах одноэлементных электрофизиологических исследований дофаминовых нейронов среднего мозга крыс после общепринятых фармакологических и нефармакологических методов лечения депрессии.

В частности, мы обнаружили, что острое воздействие либо трициклического антидепрессанта (ТЦА), имипрамина, либо один очень короткий электросудорожный шок (ECS), сопровождаемое 7-10 днями отсутствия лечения, вызывало изменение чувствительности дофаминовых ауторецепторов, которые росли, т.е. сенсибилизировались или усиливались с течением времени, что приводило к изменениям нейронов, которые были примерно на 30% больше, чем на , чем те, которые наблюдались в контрольных группах, исследованных в то же время, но подвергавшихся ежедневному воздействию лекарственного средства или ECS. ^{4, 5} Эти данные были первыми, продемонстрировавшими, что методы лечения, хорошо зарекомендовавшие себя для использования при депрессивных расстройствах, могут вызывать эффекты, которые полностью развиваются в зависимости от времени и не требуют регулярного применения. Более того, в силу того факта, что однократное воздействие ЭКС, которое все еще считается наиболее эффективным средством лечения большой депрессии, дает тот же эффект, что и лекарство, можно привести убедительный аргумент в пользу того, что TDS, даже если он вызван лекарством , не зависит от фармакокинетики.

Когда дополнительные антидепрессанты — ТЦА, амитриптилин и дезипримин, ингибитор моноаминоксидазы, фенелзин, атипичное соединение, бупропион и ингибитор обратного захвата серотонина, циталопрам ^{6, 7, 8, 9, 10} — были позже исследованы с использованием режим TDS, результаты были такими же; эффекты нарастали с течением времени в течение продолжительных периодов времени. Это было верно даже тогда, когда использовались различные процедуры тестирования (биохимические и поведенческие) и изучались другие нейротрансмиттеры (серотонин и норадреналин). ^{6, 7}

Данные, описанные выше, позволяют предположить, что TDS не ограничивался структурой отдельного соединения, методом исследования или исследуемой конечной точкой. Действительно, результаты ECS подразумевают, что это выходит за рамки лекарств. За годы, прошедшие после этих ранних исследований, их предположение о повсеместной природе TDS подтвердилось. Таким образом, это явление было продемонстрировано на множестве лекарств, различающихся как по химическому составу, так и по назначению, а также по множеству систем организма.

Среди наркотиков (в дополнение к уже отмеченным) — и химикатов — это наблюдалось со стимуляторами, амфетамином и кокаином, ^{11, 12, 13, 14} анксиолитическими, анксиогенными и снотворными бензодиазепинами, то есть диазепамом, ¹⁵ флумазенил ¹⁵ и триазолам, ^{16, 17, 18} этанол, ^{19, 20} морфин, ²¹ кленбутерол, ²² кломипрамин, ^{23, 24, 25} 2-дезокси-167 D-глюкоза, 19 цитокины, интерлейкин-1 бета, ^{26, 27} интерлейкин-2, ²⁸ фактор некроза опухоли альфа, ²⁹ анксиогены, FG7142 и пентилентетразол, ^{30, 31} эстроген, ^{32, 33, 34} антагонист кортикостерона, метирапон, ³⁵ антитело к кортикотропин-рилизинг-гормону, ³⁵ антипсихотики, галоперидол, флуфеназин и клозапин, ^{36, 37, 38, 39} липополисахарид и салин ^{эндотоксин . 19}

Системы, структуры и другие конечные точки, демонстрирующие TDS после однократного или острого воздействия соответствующего стимула, включают стриарные, мезолимбические и мезокортикальные дофаминовые пути, что отражается в изменениях в ауторецепторах, постсинаптических рецепторах, мРНК и обороте, ^{4, 5 , 13, 40, 41, 42} как α-, так и β-норадренергические рецепторы, ^{7, 22, 31} серотонин, ⁶ ГАМК, ¹⁵ аспартат, ²⁰ ацетилхолин, ⁴³ кортикостерон в плазме, ^{26 , 40, 44} кортизол, β-эндорфин и АКТГ, ^{14, 28} средний уровень аргинина вазопрессина, ^{26, 27, 45} связывание глюкокортикоидных и минералокортикоидных рецепторов в гиппокампе, ^{45, 46} отрицательная глюкокортикоидная обратная связь оксид азота, ⁴⁸ сывороточные аполипопротеины, ³² иммунная система, ⁴⁹ мозговой гликоген ⁵⁰ и индукция мРНК вителлогенина. ^{33, 34}

Разнообразие агентов, способных вызывать TDS, и множество пораженных конечных точек, а также его чрезвычайно длительный характер (по крайней мере, до месяцев после воздействия одного стимула ³⁶ ), делают это очевидным. что он не подчиняется «правилам», обычно связанным с фармакологическими явлениями. Действительно, во многих отношениях индукция TDS кажется почти противоположной тому, что мы знаем о действиях лекарств. Он проявляет скорее общность, чем специфичность, и растет, то есть усиливается с течением времени, в то время как уровни лекарств и специфические эффекты на органы-мишени обычно снижаются со временем в отсутствие дальнейшего лечения.Короче говоря, хотя это может быть вызвано лекарствами, TDS почти наверняка отражает нефармакологическое действие таких фармакологических агентов.

Несмотря на то, что врачи и ученые могут не привыкать думать о лекарствах как о чем-либо, кроме фармакологических или лекарственных средств, размышление о моментах должно сделать очевидным, что есть еще один аспект лекарств с потенциально огромными последствиями, который был полностью проигнорирован. Это факт, а не предположение, что лекарства также представляют собой чужеродные вещества для организма, увидевшего их впервые или после длительного перерыва.Более того, поскольку клеточное восприятие чужеродности всегда, вероятно, будет более или менее немедленным, в то время как фармакологические эффекты лекарства обычно занимают десятки минут, кажется «здравым смыслом», что в первую очередь следует иметь дело с чужеродным аспектом лекарств. Поскольку чужеродный стимул достаточной интенсивности, несомненно, будет восприниматься как потенциальная угроза для организма, выживание требует, чтобы адаптивный процесс, который развивается и сенсибилизируется со временем, а не повторное воздействие, приводился в движение даже после однократной встречи с таким стимулом. .Это гарантирует, что, если организм переживет первоначальный угрожающий эпизод, у него будет сенсибилизированная защитная реакция, позволяющая ему реагировать быстрее и / или сильнее, если он когда-либо снова столкнется с тем же или подобным стимулом. Мы полагаем, что TDS может быть таким адаптивным процессом и что его индукция представляет собой ответ на чужеродный аспект лекарств, а не на их специфические фармакологические действия. Доказательства, явно подтверждающие эту концепцию, были предоставлены нашим открытием, что долгосрочное сенсибилизирующее действие амфетамина на последующий амфетамин имитировалось как галоперидолом, препаратом с противоположным фармакологическим профилем, который, конечно, также является чужеродным веществом, поскольку а также его транспортное средство, которое предположительно является просто инородным веществом.Более того, комбинированное лечение амфетамином плюс галоперидолом или его носителем давало значительно больший долгосрочный эффект, чем только амфетамин. ⁴⁴ Эти данные полностью противоречат любой фармакологической интерпретации способности лекарств вызывать TDS. Они предполагают, что нельзя просто рассматривать долгосрочные эффекты лекарств как одномерный процесс, зависящий только от относительно специфических фармакологических действий данного соединения.

Читатель может возразить, что существуют наркотики — например, дофамин, норэпинефрин и физиологический раствор, — которые также являются естественными составляющими организма и поэтому не должны восприниматься как чужеродные.Тем не менее, даже с такими веществами объемы, которые, вероятно, будут введены, в сочетании со способом введения, например, путем инъекции, будут маркировать агенты как чужеродные. Следует также отметить, что любое аномальное эндогенное изменение в одной системе почти наверняка будет рассматриваться как угрожающее и, следовательно, чуждое другим системам. По сути, остальная часть тела реагирует нейрональным / гормональным эквивалентом вопроса: «Что, черт возьми, здесь происходит?» Другими словами, чужеродность — это не просто следствие введения лекарства или экзогенного нелекарственного стрессора, но также аномально большой эндогенный фактор. изменения, однако они вызваны.

Интересно отметить, что, хотя давно известно, что реакции хозяина на вакцины или другие чужеродные агенты описывают процесс, подобный TDS, до нашей работы никто не думал определить, существует ли реакция TDS на чужеродность за пределами иммунная система. Работа, описанная здесь, предполагает, что это верно для многих и, возможно, всех систем организма и что это может быть вызвано лекарствами, большинство из которых слишком малы по молекулярной массе и сложности, чтобы их можно было квалифицировать как антигены, и поэтому не ожидается, что они вызовут иммунная реакция.Это указывает на то, что TDS представляет собой систему наблюдения, реагирующую на потенциальные угрозы для организма, который более чувствителен к чужеродным веществам, чем иммунологическая память. Более того, неспецифичность TDS — в отличие от высокоспецифической природы иммунологической памяти — также предполагает, что она могла развиться раньше.

Поскольку чужеродность по определению является новинкой, а новизна давно признана стрессом для организмов, наша точка зрения подразумевает, что должно быть возможно вызвать TDS так же легко, подвергая животное нефармакологическому стрессору, как и лекарство.К настоящему времени было неоднократно показано, что это действительно так. Среди нехимических стрессоров TDS был вызван секундами громкого звонка, ⁵¹ лишение пищи, ¹² хвостовой удар, ¹¹ шок, ^{40, 45, 52} иммобилизация, ^{19, 49} укол иглой, ¹⁹ психологический стимул короткого периода в незнакомой среде, ⁴¹ хирургия головного мозга, ²⁷ комбинация некоторых из вышеперечисленных плюс стресс плавания, ⁴⁷ и, как отмечалось выше, ECS. ⁴

Из приведенного выше обсуждения не следует понимать, что любой жизненный опыт, независимо от того, насколько он безобидный или тривиальный, может вызвать долгосрочное TDS. Этот процесс зависит как от интенсивности стимула ⁴¹ — будь то лекарственный или немедикаментозный стрессор, — а также от фонового уровня реактивности организма. ^{53, 54} Таким образом, стимул одинаковой интенсивности может иметь очень разные эффекты у животных или людей, которые различаются по уровню реактивности. ⁴²

Еще одним примечательным аспектом TDS является его двунаправленность.Это может проявляться как зависящее от времени усиление или торможение. Интенсивность индуцирующего стимула играет ключевую роль в определении направления TDS, при этом агенты «более низкой» интенсивности приводят к усилению, а агенты «более высокой» интенсивности — к уменьшению эффектов одного и того же соединения. Это свойство TDS хорошо проиллюстрировано в исследовании, в котором сравнивались экологические, метаболические (явно разные дозы метаболического стрессора, 2-дезокси-D-глюкозы) и фармакологические (заметно разные дозы этанола) «более низкие» и «более» интенсивности окружающей среды. ) стрессоров с точки зрения их влияния на каталепсию галоперидола, измеренную через 1-2 часа или 2 недели спустя.Независимо от типа используемого стрессора, стимулы меньшей интенсивности всегда усиливались, тогда как стимулы более высокой интенсивности всегда уменьшали влияние галоперидола в течение более длительного, но не более короткого периода тестирования. Другими словами, как потенцирующее, так и тормозящее действие усиливались с течением времени. ¹⁹ Долгосрочное, зависящее от времени усиление или ингибирование связывания минералокортикоидов и рецепторов глюкокортикоидов в гиппокампе также наблюдалось после кратковременного воздействия стрессовых стимулов различной степени тяжести. ⁴⁶

Животная модель аллергии на пшеницу для сенсибилизации кожи: сравнительное исследование у наивных и толерантных бурых норвежских крыс — FullText — International Archives of Allergy and Immunology 2019, Vol. 178, № 2

Аннотация

Общие сведения: Аллергическая сенсибилизация к продуктам питания может возникать в младенчестве без предварительного перорального контакта с вредной пищей, что позволяет предположить, что пищевая аллергия может происходить через кожу.Высказывались опасения относительно безопасности использования продуктов личной гигиены, содержащих гидролизованные протеины пшеницы, поскольку было показано, что эти продукты вызывают аллергию через кожу и даже вызывают отмену уже установленной пероральной переносимости. Цель: Создать модель на животных для сенсибилизации кожи пищевой аллергии и сравнить сенсибилизирующую способность немодифицированного и кислотно-гидролизованного продукта глютена через слегка поврежденную кожу у наивных и толерантных крыс. Методы: Глютеновые продукты наносили на слегка поврежденную кожу наивных или толерантных крыс Brown Norway (BN) без адъюванта 3 раза в неделю в течение 3 или 5 недель подряд. Эффект кожных аппликаций оценивали с помощью различных ELISA и иммуноблоттинга. Результаты: Была разработана надежная животная модель для сенсибилизации кожи пищевой аллергии. У неопытных крыс оба продукта глютена были способны индуцировать статистически значимый уровень специфических антител и сенсибилизировать через кожу, но у устойчивых к пшенице крыс только кислотно-гидролизованный глютен был способен сенсибилизировать через кожу, хотя и на уровне намного ниже, чем у наивных крыс.Результаты показали, что новые эпитопы были разработаны в результате кислотного гидролиза, но оригинальные эпитопы сохранились. Это может объяснить, почему только кислотно-гидролизованный глютен может вызывать специфические реакции антител у толерантных животных. Выводы: Это исследование показало, что сенсибилизация крыс линии BN возможна через слегка поврежденную кожу, и что на сенсибилизирующую способность сильно влияет статус толерантности их иммунной системы и степень модификации продуктов из пшеницы.

© 2018 Автор (ы) Опубликовано S. Karger AG, Базель

Введение

Пищевая аллергия, опосредованная иммуноглобулином E (IgE), является наиболее распространенным типом побочной реакции на пищевые белки. Это связано с присутствием аллерген-специфического IgE, который возник после фазы сенсибилизации, за которой следует фаза выявления, вызывая аллергическую реакцию [1]. По умолчанию иммунный ответ на пищевые антигены в желудочно-кишечном тракте — это активная иммунная толерантность, а именно оральная толерантность [2]. Отсутствие или отмена пероральной толерантности может вызвать сенсибилизацию. Сообщалось, что аллергические реакции на пищевые продукты возникают после первого известного приема внутрь, что предполагает сенсибилизацию не через желудочно-кишечный тракт [3].

Кожа — альтернативный путь сенсибилизации. Это уникальный орган, который служит защитным барьером между организмом хозяина и его внешней средой. Сведение к минимуму потери воды из организма и предотвращение проникновения патогенов и аллергенов в организм могут быть основными функциями кожи [4].Субъекты с нарушенными барьерными функциями, такими как атопический дерматит (AD) или мутация потери функции в гене филаггрина, имеют повышенный риск развития пищевой аллергии [5, 6]. Это было предложено, в частности, в отношении аллергии на арахис [7, 8]. Индукция пищевой аллергии из-за воздействия на кожу пищевых белков до конца не изучена; это делает его очень актуальным для расследования.

Признаки повышенной пищевой аллергии через кожу, а также более широкое использование натуральных материалов и их производных в продуктах личной гигиены, предназначенных для нанесения на кожу, вызвали опасения по поводу безопасности таких продуктов. Натуральные компоненты, содержащиеся в продуктах личной гигиены, могут быть белками некоторых основных аллергенных продуктов, таких как коровье молоко, арахис, соя и пшеница [8-10]. В частности, протеины пшеницы и их производные используются в составе различных косметических средств и средств личной гигиены [11]. Именно качество глютена придает пшенице уникальные свойства, включая способность к водопоглощению, вязкости и эластичности [12]. Глютен содержит сотни белков, присутствующих в виде мономеров, олигомеров или полимеров [13].

По определению, белки глютена не растворяются в воде. Гидролиз ферментами или кислотой может изменить их структуру и размер и привести к образованию растворимых белковых гидролизатов. Процедура и степень гидролиза зависят от желаемой функции и производителя. Кроме того, обработка кислотой может привести к частичному дезамидированию белков. Химическое дезамидирование глютена удаляет амид из глутамина или аспарагина, образуя соответствующую карбоновую кислоту, глутамат или аспартат вместе со свободным аммиаком. Этот процесс изменяет потенциальный заряд и, таким образом, увеличивает растворимость глютена [14, 15]. Кислотный гидролиз глютена вызывает эмульгирующие свойства, что делает его полезным в различных пищевых продуктах, а также в средствах личной гигиены для волос и тела [16]. Сообщалось, что в разных частях мира гидролизованные белки пшеницы вызывают пищевые аллергические реакции, даже анафилаксию, у пациентов, устойчивых к пшенице [17-20]. Сюда входят случаи аллергических кожных реакций после применения средств личной гигиены, содержащих гидролизованные протеины пшеницы [16, 17, 21].Мыло для лица, содержащее кислотно-гидролизованные протеины пшеницы, особенно в Японии, вызывает аллергические реакции на продукты из пшеницы. Аллергическими реакциями были кожные симптомы и анафилаксия, вызванная физической нагрузкой, вызванная пшеницей (WDEIA) [17, 22]. Кислотный гидролиз глютена может изменить структуру эпитопа и тем самым повлиять на реакцию иммунной системы. Способность кислотно-гидролизованного глютена вызывать сенсибилизацию de novo и возможность нарушения уже установленной пероральной толерантности к немодифицированным белкам пшеницы усилили опасения по поводу безопасности использования этих белков в продуктах личной гигиены.

Животные модели могут способствовать пониманию роли сенсибилизации белков через кожу. Трудно изучить фазу сенсибилизации у людей, поскольку мы подвергаемся неконтролируемому воздействию разнообразных пищевых и вдыхаемых аллергенов с течением времени, а также по этическим причинам. Таким образом, оправдано использование животных моделей, на которых можно контролировать воздействие аллергенов и которые позволяют проводить обширные исследования в рамках четко определенного генетического фона. Различные модели на животных показали, что может происходить сенсибилизация через кожу [23–26].Аллергены наносили на неповрежденную кожу или на кожу, механически поврежденную в результате удаления ленты [24, 25, 27]. В моделях на животных использовались различные пищевые аллергены, такие как экстракты белка арахиса, фундука и кешью, а также яичный альбумин куриного яйца (OVA), что приводило к повышенным уровням антигенспецифического IgE [24–27]. В нескольких исследованиях на животных изучались аллергические реакции на гидролизованные продукты из пшеницы [28-30]. В этом исследовании цель состояла в том, чтобы создать животную модель сенсибилизации кожи пищевой аллергии и изучить сенсибилизирующую способность немодифицированного и кислотно-гидролизованного продукта глютена у наивных и толерантных крыс Brown Norway (BN).

Материалы и методы

Глютеновые продукты

Два разных глютеновых продукта, то есть немодифицированный и кислотно-гидролизованный глютен, были любезно предоставлены Tereos Syral (Алст, Бельгия). Их растворяли в стерильном PBS (137 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 8 мМ Na ₂ HPO ₄ × 2H ₂ O и 1 мМ KH ₂ PO ₄ в воде Milli Q, pH 7,2. ) перед использованием. Было показано, что содержание эндотоксина в обоих продуктах составляет <10 EU / мг белка с помощью набора для количественного определения хромогенного эндотоксина Pierce ^TM LAL (ThermoFisher Scientific, Массачусетс, США) в соответствии с инструкциями производителя.

Животные. Использовали

крыс BN из домашних племенных колоний в Национальном продовольственном институте Технического университета Дании. Крыс выращивали и разводили либо на (1) домашней диете, не содержащей пшеницу [31] в течение> 3 поколений, чтобы гарантировать иммунологически наивных животных в отношении белков пшеницы, либо (2) на обычном крысином корме, содержащем пшеницу (Altromin 1314, с содержание белка 6,73%, происходящего из глютена, Altromin, Lage, Германия). Использовали животных обоего пола в возрасте 5–8 недель.Животных содержали в клетках для макролонов ( n = 3 / клетка) при температуре 22 ± 1 ° C и относительной влажности 55 ± 5%. Воздух меняли 8–10 раз в час, а электричество было с 9.00 до 21.00. Диета и подкисленная вода давались ad libitum. Животных осматривали дважды в день, и каждую неделю регистрировали массу тела. В конце исследований все животные были подвергнуты обескровливанию с использованием углекислого газа в качестве анестезии. Кровь собирали, превращали в сыворотку и хранили при –20 ° C до анализа.

Исследования на животных

Пилотные исследования: гистология кожи и испарение воды

Во всех пилотных исследованиях крыс разводили и выращивали на диете без пшеницы. Первым шагом в разработке модели на животных является создание надежного и воспроизводимого метода нанесения продуктов, используемых для сенсибилизации, при котором можно контролировать состояние кожи.

Пилотный эксперимент 1

Были протестированы различные методы удаления волос на животе: электробритва, бритва и 3 различных крема для депиляции (Silkia, Lino Care Ltd., Манчестер, Великобритания; аптечный крем для депиляции, Glostrup Pharmacy, Glostrup, Дания; и Veet, Reckitt Benckiser, Слау, Великобритания). Кремы использовались в соответствии с инструкциями производителей. После удаления шерсти животных 10 раз зачищали целлофановой лентой. Их забивали сразу после удаления волос или удаления ленты, а затем кожу вырезали, заливали парафином, разрезали и окрашивали гематоксилином и эозином (HE) для визуализации слоев кожи.

Мы решили удалить волосы электробритвой, так как это было эффективно и не повредило кожу.

Пилотный эксперимент 2

Из пилотного эксперимента 1 мы знали, что бритье с удалением ленты или без нее не повреждает эпидермис. Чтобы получить 1 модель с неповрежденной кожей и 1 со слегка поврежденной кожей, мы ввели легкую царапину наждачной бумагой (зернистость 400). Мы также хотели изучить влияние (гистология и испарение воды) на кожу повторения процедур в течение нескольких недель.

Двенадцать животных были разделены на 6 групп. Всех животных брили на животе, царапали и обрабатывали в области примерно 1 × 1 см ² .Одному животному в каждой группе вводили PBS, а другому — кислотно-гидролизованный глютен. Дозирование и режим дозирования были описаны в следующем разделе: «Создание модели сенсибилизации кожи крысы». Первые 2 животных были умерщвлены сразу после первого дня введения дозы. Впоследствии 2 животных были умерщвлены через 2 дня после первого, второго, третьего, четвертого или пятого периода дозирования соответственно. Кожу собирали и окрашивали HE.

Для дальнейшего изучения состояния кожи в связи с обработкой кожи и нанесением продукта испарение воды измерялось из области нанесения на кожу.Двенадцать животных были разделены на 2 группы: 1 группа получала дозу PBS, а 1 группа — глютен, гидролизованный кислотой. Всем животным брили живот и царапали, как описано выше для гистологического исследования, а затем вводили дозу, как описано ниже. Все 12 крыс были умерщвлены через 2 недели кожного нанесения. Испарение воды измеряли 3 раза в течение примерно 20 с на каждом этапе нанесения на кожу, до и после бритья, после расчесывания и после нанесения в течение 1 часа. Испарение воды измеряли с помощью Tewameter® TM 300 (Courage + Khazaka Electronic GmbH, Кельн, Германия).Результаты измерений испарения воды выражаются как уровень трансэпидермальной потери воды (TEWL).

Создание модели сенсибилизации кожи крыс

Крысы, включенные в это исследование, были выведены и выращены на диете, не содержащей пшеницы. Крыс брили на животе электробритвой (Oster, PowerPro Ultra, blade 50). Каждую неделю кожа слегка повреждалась, царапаясь наждачной бумагой (зернистость 400). После предварительной обработки 100 мкл PBS или 100 мкл PBS с 50 или 500 мкг немодифицированной клейковины или кислотно-гидролизованной клейковины наносили на область размером 1 × 1 см ² без использования адъюванта.Во избежание орального воздействия на кожу наложили эластичную марлевую повязку, обернутую вокруг живота. Крыс помещали в клетку поодиночке на 1 ч. После этого зону дозирования промывали водой, и крыс помещали в их исходные клетки. Продукты наносили на кожу в течение 1 ч в день в течение 3 дней подряд, после чего крысы отдыхали в течение 4 дней. Это повторялось в течение 3 или 5 недель. После кожной аппликации крыс дважды иммунизировали с интервалом в 1 неделю (рис. 1). Крыс иммунизировали либо внутрибрюшинно (т.е.p., 50 мкг в 0,5 мл стерильного PBS) или через зонд (50 мг в 1 мл стерильного PBS) с тем же продуктом, который наносили на кожу. Контрольных крыс, обработанных PBS, иммунизировали кислотно-гидролизованным глютеном. Крыс умерщвляли через 1 неделю после последней постиммунизации, кровь собирали и хранили при –20 ° C до использования.

Рис. 1.

План эксперимента на животных. Группам из 6 крыс Brown Norway наносили дозу на кожу путем нанесения PBS (контроль), немодифицированного глютена или кислотно-гидролизованного глютена в течение 1 ч / день в течение 3 дней подряд в течение 3 или 5 недель.Впоследствии были проведены 2 пост-иммунизации с интервалом в 1 неделю. Образцы крови собирали на протяжении всего исследования. Крыс умерщвляли на 49 день (фото: Colourbox.com).

Сравнение наивных и толерантных крыс

Крыс разводили и выращивали либо на диете, не содержащей пшеницу, либо на обычном крысином корме. Это исследование было выполнено, как описано выше, за следующими исключениями: крысам вводили PBS, 500 мкг немодифицированного глютена или кислотно-гидролизованного глютена. Сенсибилизацию кожи проводили в течение 5 недель с последующими 2 пост-иммунизациями через желудочный зонд (50 мг в 1 мл стерильного PBS).

Иммуноферментный анализ, связанный с ферментом

Сыворотки из исследований сенсибилизации кожи были проанализированы с помощью различных ELISA на специфический IgG ₁ , специфический IgE, авидность и конкурентоспособность двух продуктов. Для всех экспериментов ELISA все реагенты и периоды инкубации были при комнатной температуре (RT) в темноте на встряхиваемом столе в течение 1 ч, если не указано иное. Между каждым этапом планшеты для ELISA промывали 5 раз PBS с 0,01% (мас. / Об.) Tween 20 (PBS-T). Положительные и отрицательные контрольные пулы сыворотки были включены в каждый планшет для непрямого ELISA и ELISA с захватом антител.Для развития ферментативной реакции планшеты инкубировали в течение 12 мин со 100 мкл / лунку TMB ONE ^TM (4380A, Kementec Diagnostics, Taastrup, Дания). Реакцию останавливали добавлением 100 мкл / лунку 0,2 М серной кислоты. Поглощение измеряли при 450–630 нм. Пределы обнаружения определяли как среднее значение поглощения сыворотки отрицательного контроля плюс трехкратное стандартное отклонение (SD).

Обнаружение специфических IgG

Для обнаружения немодифицированных и кислотно-гидролизованных глютен-специфических IgG ₁ 96-луночные планшеты Maxisorp (NUNC, Роскилле, Дания) покрывали в течение ночи при 4 ° C 100 мкл / лунка 2 мкг / мл немодифицированного или кислотно-гидролизованного глютена в карбонатном буфере (15 мМ Na ₂ CO ₃ × 10 H ₂ O, 35 мМ NaHCO ₃ , pH 9.6). Планшеты инкубировали с 50 мкл / лунку серийно разведенной в 2 раза крысиной сывороткой в ​​PBS-T, начиная с 1: 8. Затем планшеты инкубировали со 100 мкл / лунку вторичных антител, мышиных антител к крысиным IgG ₁ , меченных хреном. пероксидаза (HRP, 3060-05, Southern Biotech, Бирмингем, Алабама, США), разведенная 1: 20 000 в PBS-T. После этого планшеты дважды промывали водопроводной водой и проявляли. Значения выражены в виде титров log ₂ с пороговым значением оптической плотности (OD) 0,1.

Обнаружение специфического IgE с помощью ELISA с захватом антител

Для обнаружения специфического IgE выполняли ELISA с захватом антител.Планшеты Maxisorp покрывали в течение ночи при 4 ° C 100 мкл / лунку 0,5 мкг / мл мышиных антител к крысиным IgE (HDMAB-123 HydriDomus, Ноттингем, Великобритания) в карбонатном буфере (pH 9,6). После нанесения покрытия планшеты блокировали в течение 1 ч при 37 ° C 200 мкл / лунку 3% (об. / Об.) Кроличьей сыворотки (S2500, Almeco, Esbjerg, Дания) в PBS-T для обнаружения немодифицированного глютен-специфического IgE. или 3% (мас. / об.) сухого обезжиренного молока (SMP, 70166, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в PBS-T для обнаружения кислотно-гидролизованного глютен-специфического IgE. После блокировки планшетов добавляли образцы сыворотки крыс в серийном 2-кратном разведении, начиная с 1: 8 в PBS-T.Затем планшеты инкубировали с 50 мкл / лунку немодифицированного глютена, связанного с дигоксигенином (DIG), разведенного 1: 500 в 3% (об. / Об.) Кроличьей сыворотки, или DIG-связанного кислотно-гидролизованного глютена, разведенного 1: 4000 в 3% ж / в) SMP. Продукты были связаны в соотношении 1:20 (продукт: DIG). Затем планшеты инкубировали с 100 мкл / лунку меченных HRP овечьих антител против DIG-POD (11633716001, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), разведенных 1: 1000 в PBS-T. Перед проявлением планшеты дважды промывали в водопроводной воде. Значения специфического IgE выражены в виде log ₂ титров с индивидуальным отсечением для каждого планшета в соответствии с положительным и отрицательным контролями.

Ингибирующий ELISA

Для изучения конкурентной способности связывания антител с немодифицированной и кислотно-гидролизованной глютеном был проведен IgG ₁ ингибиторный ELISA. Планшеты Maxisorp покрывали, как для непрямого ELISA. Тест проводился на объединенных сыворотках по группам. Объединенные сыворотки разводили в PBS-T для достижения OD около 1 в отсутствие ингибитора. Сыворотки предварительно инкубировали в течение 1 ч с последовательным 10-кратным разведением двух продуктов глютена по отдельности в качестве ингибиторов.После предварительной инкубации сывороток и продуктов глютена в планшеты добавляли дубликаты смеси сыворотка / ингибитор. Впоследствии этот анализ выполнялся так же, как и для непрямого ELISA. Ингибирующий ИФА проводили дважды. Результаты выражаются в процентах ингибирования по отношению к концентрации ингибитора.

ELISA на авидность

Для измерения силы связывания между двумя продуктами и специфическим IgG ₁ проводили ELISA на авидность. Планшеты Maxisorp покрывали так же, как и для непрямого ELISA.Планшеты инкубировали в четырех повторах с 50 мкл / лунку образцов крысиной сыворотки, разведенных в PBS-T. Разведения делали для достижения OD около 1. После инкубации с сывороткой крыс планшеты инкубировали в течение 30 мин с 50 мкл / лунку серийного 2-кратно разведенного тиоцианата калия (KSCN) (P2713, Sigma-Aldrich), начиная с концентрация 4 М. Следующая процедура была такой же, как для непрямого ELISA. Результаты выражены в процентах ингибирования концентрации KSCN. Половинную максимальную ингибирующую концентрацию (IC ₅₀ ) определяли для каждого животного.

Immunoblot

Образцы для SDS-PAGE были приготовлены с 40 мкг белка в 2-кратном буфере для образцов Лэммли (1: 1) (1610737, Bio-Rad, Калифорния, США) и β-меркаптоэтаноле (1:40) (1610710, Bio-Rad) и нагревали 5 мин при 95 ° C. Готовый мини-гель протеина (гель Mini PROTEAN TGX без пятен, 4568093, Bio-Rad) загружали подготовленными образцами в рабочем буфере (10 × Трис / глицин / SDS буфер, 1610732, BIO-RAD). Использовали неокрашенный стандарт Precision plus (1610363, Bio-Rad). SDS-PAGE выполняли при 200 В в течение 30 мин.

Гели активировали в ChemiDoc в течение 1 мин. Впоследствии белки были перенесены на мембрану из PVDF с использованием турбо-упаковки для переносных блотов (1704156, Bio-Rad). После переноса мембраны промывали 3 × 5 мин в PBS-T и затем блокировали 5% (мас. / Об.) SMP в течение ночи при 4 ° C. Мембраны инкубировали с объединенными сыворотками из исследования сенсибилизации кожи, разведенными 1: 100 или 1: 1000 в блокирующем растворе, в течение ночи при 4 ° C. Мембраны промывали 3 раза по 5 минут в PBS-T и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре со вторичными антителами, мышиными анти-крысиными IgG ₁ -HRP, разведенными 1: 1000 в блокирующем растворе, вместе с конъюгатом StrepTactin HRP для визуализации стандарта. разбавленный 1: 10 000.Мембраны промывали и проявляли реагентом Clarity Western ECL (1705060, Bio-Rad) в течение 5 мин при комнатной температуре. Мембраны получали с помощью ChemiDoc XRS + (Bio-Rad).

Статистический анализ

Анализ кривых и статистический анализ выполняли с использованием GraphPad Prism v7.03 (Сан-Диего, Калифорния, США). Различия в TEWL были проверены на дисперсию с помощью одностороннего теста ANOVA с множественными сравнениями. Кривые, полученные из авидности и ингибирующего ELISA, тестировали на дисперсию с помощью однофакторного дисперсионного анализа, теста Бартлетта на равные дисперсии, а затем теста множественных сравнений Тьюки.Не было получено статистически значимых отклонений между кривыми, что позволило рассчитать значения IC ₅₀ . Рассчитанные значения IC _{, 50,} и титра антител были исследованы на предмет групповых различий с использованием непараметрического однофакторного дисперсионного анализа ANOVA Краскела-Уоллиса с последующим тестом множественных сравнений Данна для сравнения всех групп или групп, получавших один и тот же продукт. U-критерий Манна-Уитни использовался для сравнения двух групп при тестировании различий в продолжительности и дозозависимом ответе, наивных и толерантных крысах и авидности.Звездочками отмечены статистически значимые различия между данными группами: * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001.

Результаты

Механическое разрушение кожного барьера увеличивает толщину внешнего слоя кожи

Для разработки модели на животных, на которой состояние кожи можно было бы контролировать, были проведены пилотные исследования для проверки наиболее подходящего способа удаления волос и легкого повреждения кожа.Эпидермальный слой нормальной кожи живота крысы имеет толщину в несколько слоев клеток и не имеет отчетливого зернистого слоя. Кератин образует компактный тонкий внутренний слой (stratum lucidum) и диффузный внешний слой (stratum corneum) (рис. 2а). Бритье или бритье с последующим снятием тейпа мало повлияли на целостность эпидермиса и кератинового слоя (рис. 2b, c).

Рис. 2.

Состояние кожи после эпиляции. Окрашенные участки кожи живота. ОН. a Без обработки. b Бритая. c Бритая, без скотча. d Волосы, удаленные кремом (стрелкой показан внутренний кератин и клеточный слой). e Волосы, удаленные кремом и зачищенные лентой (стрелкой показано повреждение внутреннего слоя кератина). Животных умерщвляли сразу после обработки.

Напротив, удаление волос кремом для депиляции в соответствии с инструкциями производителя удаляет не только волосы, но и внешний кератиновый слой, оставляя внутренний кератин и слой клеток морфологически нетронутыми (рис.2г). Когда кожа, обработанная кремом для депиляции, была снята, внутренний кератиновый слой был в значительной степени удален (рис. 2e). Сразу после удаления волос кремом для депиляции кожа выглядела нормальной; однако через пару часов кожа живота стала раздражаться, и крысы начали чесаться до такой степени, что их пришлось умертвить. Эти результаты демонстрируют, что удаление волос кремом для депиляции не оставляет неповрежденным кожный барьер. Чтобы иметь возможность контролировать состояние кожи, а также по этическим соображениям, мы решили отказаться от использования депиляционного крема для удаления волос.

Поскольку мы хотели получить модель со слегка поврежденным эпидермальным барьером, была разработана модель, сочетающая удаление волос с бритьем с последующим расчесыванием наждачной бумагой. Макроскопически было показано, что царапанье наждачной бумагой повреждает кожу, и, основываясь на гистологическом исследовании (рис. 3а), было очевидно, что царапание удаляло эпителиальный слой спорадически, оставляя большую часть эпидермиса нетронутой, т.е. желаемую ситуацию.

Рис. 3.

Состояние кожи после многократных применений.Окрашенные участки кожи живота. ОН. a Бритые, поцарапанные и обработанные (PBS) крысы, взятые сразу после лечения (стрелка показывает царапающую рану. b Бритые, поцарапанные и получавшие дозу (PBS) крысы через 2 дня после последнего нанесения на кожу в течение 1 недели (стрелка показывает слой granulosum). c Бритые, поцарапанные и обработанные (PBS) крысы через 2 дня после последнего нанесения на кожу в течение 3 недель (стрелка показывает stratum granulosum). d Побритые, поцарапанные и обработанные (кислотно-гидролизованный глютен) крысы 2 дней после лечения в течение 5 недель (стрелкой показан гранулированный слой).

Пилотные исследования включали бритье, расчесывание и дозирование в день 0 с последующим приемом в дни 1 и 2. Этот режим повторялся каждую неделю в течение 5 недель. За исключением первых 2 животных, умерщвленных сразу после первой дозы в день 0, всех животных умерщвляли через 2 дня после периода дозирования, по 2 животных каждую неделю. На тот момент эпидермис был неповрежденным, с внутренним и внешним кератиновым слоем, но также с очень отчетливым зернистым слоем. Это увеличение зернистого слоя началось уже после первой недели (рис.3b) и продолжалась с аналогичной индукцией продукции кератина в последующие недели (рис. 3c, d), что указывает на утолщение эпидермиса в результате механического напряжения, вызванного царапанием наждачной бумагой. Не было гистологических различий между животными, которым вводили PBS, и животными, которым вводили кислотно-гидролизованный глютен.

Испарение воды измерялось до и после бритья, после расчесывания (перед нанесением) и через 1 час после нанесения. В соответствии с гистологией, различий между двумя группами не наблюдалось.На рисунке 4а показано, что после бритья не наблюдалось увеличения испарения воды, тогда как после расчесывания и через 1 час после нанесения наблюдалось наибольшее увеличение TEWL. Эта картина наблюдалась в дни 0 и 7 с наибольшим увеличением TEWL, наблюдаемым в день 0. Действительно, согласно TEWL, похоже, что второй приступ расчесывания не повредил кожу так сильно, как первый. Это очень хорошо коррелирует с гистологией, где индукция выработки кератина может быть обнаружена после многократного расчесывания и нанесения.Глядя на отдельных животных, у большинства не наблюдалось увеличения TEWL после бритья, тогда как значительное увеличение TEWL наблюдалось после расчесывания и укутывания (рис. 4b). Наблюдались различия между животными, и у некоторых животных наблюдалось лишь небольшое увеличение потери воды после расчесывания и нанесения (рис. 4c).

Рис. 4.

Испарение воды с кожи, измеренное до и после бритья, после расчесывания (или перед нанесением) и через 1 час после нанесения. a Трансэпидермальная потеря воды (TEWL) у 12 животных (как PBS, так и животные, получавшие кислотно-гидролизованный глютен) через 2 недели после нанесения на кожу. b TEWL от отдельного животного в день 0, представляющего большинство животных. c TEWL от отдельного животного в день 0 только с небольшим увеличением TEWL, представляющим несколько животных. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение. Показаны статистически значимые различия между указанными группами: ** p <0,01, **** p <0.0001.

Модель сенсибилизации кожи крысы выявила реакции, зависящие от продолжительности и дозы

Для создания надежной модели сенсибилизации кожи на животных, 2 различных продолжительности нанесения на кожу (т. Е. 3 и 5 недель), 2 различных дозы (50 и 500 мкг) и 2 различных режима иммунизации (внутрибрюшинно и перорально). Иммуногенность и аллергенность немодифицированной и кислотно-гидролизованной глютена оценивали с помощью анализов специфических IgG ₁ и IgE.

Для создания животных моделей пищевой аллергии на кожную сенсибилизацию PBS, немодифицированный глютен или кислотно-гидролизованный глютен наносили на кожу живота наивных крыс на 3 или 5 недель (рис. 1). Анализ ответов антител показал, что оба продукта способны индуцировать высокие уровни специфического IgG ₁ как в 3-, так и в 5-недельные периоды дозирования без постиммунизации (фиг. 5a). Если посмотреть на специфический ответ IgE, оба продукта были способны индуцировать специфические антитела IgE (рис.5b, c), хотя через 5 недель до более высокого уровня, чем через 3 недели кожного нанесения. Результаты продемонстрировали возможность сенсибилизации крыс линии BN без использования адъюванта через слегка поврежденную кожу как немодифицированным, так и кислотно-гидролизованным глютеновым продуктом. Также были изучены различные режимы дозирования. Немодифицированный или кислотно-гидролизованный глютен наносили на кожу живота крыс в 2 различных дозах, 50 или 500 мкг. Нанесение на кожу продолжалось в течение 5 недель с последующими 2 пероральными зондированиями.Сопоставимые уровни специфического IgG ₁ (фиг. 5d) были получены после дозирования 50 и 500 мкг. При сравнении доз 50 и 500 мкг не было обнаружено статистически значимой разницы с немодифицированным глютен-специфическим IgE (фиг. 5e), но статистически значимая разница наблюдалась с кислотно-гидролизованным глютен-специфическим IgE (фиг. 5f).

Рис. 5.

Сравнение специфических уровней IgG ₁ и IgE. a – c До постиммунизации (35 день). d – f После иммунизации (49 день). a Уровень IgG к продукту ₁ через 3 или 5 недель нанесения на кожу 500 мкг белка. b Немодифицированный глютен-специфический IgE через 3 или 5 недель кожного нанесения с 500 мкг белка. c Кислотно-гидролизованный глютен-специфический IgE через 3 или 5 недель кожного нанесения с 500 мкг белка. d Продукт-специфический IgG ₁ после дозирования 50 или 500 мкг глютенового продукта и двух пероральных пост-иммунизаций. e Немодифицированный глютен-специфический IgE после дозирования 50 или 500 мкг и двух пероральных пост-иммунизаций. f Кислотно-гидролизованный глютен-специфический IgE после дозирования 50 или 500 мкг и двух пероральных пост-иммунизаций. Каждый символ представляет 1 животное, а горизонтальные полосы указывают среднее значение. Показаны статистически значимые различия между указанными группами: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. Un Glu, немодифицированный глютен; Ac Glu, кислотно-гидролизованный глютен.

Были проведены две постиммунизации, чтобы определить, были ли некоторые животные примированы к сенсибилизации после нанесения на кожу без индукции измеримых уровней специфических антител IgE.Результаты показали, что в целом более высокие уровни специфического IgE наблюдались после 2 постиммунизаций по сравнению с нанесением только на кожу. И оральный зонд, и внутрибрюшинный. пост-иммунизации были протестированы, но, к удивлению, более стойкая реакция наблюдалась после перорального желудочного зондирования, которое мы затем решили использовать в следующих процедурах, и самая высокая концентрация (500 мкг) и самая большая продолжительность применения (5 недель) были выбраны в чтобы сравнить сенсибилизирующую способность немодифицированного и кислотно-гидролизованного глютена у крыс, ранее не получавших пшеницу, и крыс, устойчивых к пшенице.

Наивные крысы могли быть сенсибилизированы к обоим глютеновым продуктам, в то время как только кислотно-гидролизованная глютен могла нарушить пероральную толерантность у толерантных крыс

Для проверки иммуногенности и аллергенности немодифицированной и кислотно-гидролизованной глютена у наивных крыс по сравнению с толерантными после нанесения на кожу были проанализированы специфические IgG _{, 1,} и антитела IgE.

У наивных крыс как немодифицированный, так и кислотно-гидролизованный глютен индуцировал статистически значимый специфический ответ IgG ₁ через 5 недель сенсибилизации кожи (рис.6а). У толерантных крыс обнаруживаемые уровни специфического IgG ₁ наблюдались во всех группах, независимо от применения, например, PBS, немодифицированного глютена или кислотно-гидролизованного глютена, в результате повышения специфических антител к пшенице из-за пшеницы. -содержащий корм. Только применение кислотно-гидролизованной глютена вызывало небольшое повышение специфических антител, но статистически значимых различий не наблюдалось.

Рис. 6.

Сравнение специфических уровней IgG ₁ и IgE у наивных и толерантных крыс.Всем крысам вводили 500 мкг белка. a – c До постиммунизации (35 день). d – f После иммунизации (49 день). a Специфический для продукта IgG ₁ через 5 недель нанесения на кожу. b Немодифицированный глютен-специфический IgE через 5 недель кожного нанесения. c Кислотно-гидролизованный глютен-специфический IgE после 5 недель нанесения на кожу. d Продукт-специфический IgG ₁ после 2 пероральных постиммунизаций. e Немодифицированный глютен-специфический IgE после 2 пероральных постиммунизаций. f Кислотно-гидролизованный глютен-специфический IgE после 2 пероральных постиммунизаций. Каждый символ представляет 1 животное, а горизонтальная полоса указывает среднее значение. Показаны статистически значимые различия между указанными группами: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Un Glu, немодифицированный глютен; Ac Glu, кислотно-гидролизованный глютен.

У наивных крыс как немодифицированный, так и кислотно-гидролизованный глютен были способны индуцировать специфические антитела IgE (рис.6б, в) и сенсибилизируют крыс через слегка поврежденную кожу без использования адъюванта. У толерантных крыс наблюдался только 1 ответчик IgE, который был в группе, получавшей кислотно-гидролизованный глютен.

Ответы антител после 2 пероральных постиммунизаций выявили уровень специфического IgG ₁ , аналогичный уровню после нанесения только на кожу как у наивных, так и у толерантных крыс (фиг. 6d). У неопытных крыс более высокие уровни специфического IgE (рис. 6e, f) были очевидны после 2 пост-иммунизаций для обеих групп; у толерантных крыс только те, которым вводили кислотно-гидролизованный глютен, имели повышенный уровень специфического IgE.Результаты ясно показывают, что у наивных крыс индуцировались более высокие уровни специфического IgE, чем у толерантных крыс, что указывает на то, что у наивных крыс было легче сенсибилизировать, чем у толерантных крыс.

Чтобы определить, могут ли существовать различия в характере связывания антител, вырабатываемых у толерантных и наивных крыс, а также между антителами, вырабатываемыми против немодифицированной и кислотно-гидролизованной глютена, был проведен иммуноблоттинг. Это выявило различия в характере связывания между толерантными и неопытными крысами, независимо от того, получали ли крысы немодифицированные дозы (рис.7b, d) или кислотно-гидролизованной клейковины (рис. 7c, e). Например, у толерантных крыс, которым вводили кислотно-гидролизованный глютен, две полосы были более выраженными, около 75 и 30 кДа, чем у наивных крыс. У наивных крыс одна большая область была более выражена в области около 50 кДа, чем у толерантных крыс. Это указывает на то, что связывание эпитопа и реактивность белков различаются у толерантных и неопытных крыс. Различия в характере связывания также наблюдались у крыс, получавших немодифицированный глютен, и крыс, получавших кислотно-гидролизованный глютен, независимо от того, применялись ли продукты у толерантных или наивных крыс.Это указывает на то, что антитела были разработаны против разных эпитопов и что профили реактивности белков различались между двумя продуктами из глютена.

Рис. 7.

IgG ₁ иммуноблот. Сравнение характера связывания IgG ₁ с немодифицированным глютеном и кислотно-гидролизованным глютеном. SDS-PAGE выполняли с двумя продуктами глютена, и белки переносили на PVDF-мембрану. Мембраны инкубировали с пулами сыворотки от толерантных ( a – c ) и наивных ( d , e ) крыс, которым на кожу вводили PBS ( a ), 500 мкг немодифицированного глютена ( b , d ) или 500 мкг кислотно-гидролизованной глютена ( c , e ) с последующими 2 пероральными пост-иммунизациями.Un Glu, немодифицированный глютен; Ac Glu, кислотно-гидролизованный глютен.

Для анализа перекрестной реактивности между двумя продуктами глютена был проведен ELISA ингибирования. На фигуре 8а показано, что кислотно-гидролизованный глютен был способен полностью ингибировать связывание между немодифицированным глютеном и антителами IgG ₁ , индуцированными против немодифицированного глютена. Это могло быть выполнено только с сывороткой от наивных крыс из-за низкого количества антител у толерантных крыс. Напротив, немодифицированный глютен не был способен полностью ингибировать связывание между кислотно-гидролизованным глютеном и антителами IgG ₁ , индуцированными против кислотно-гидролизованного глютена (рис.8б). Это было наиболее ярко выражено для антител IgG ₁ , вырабатываемых у толерантных крыс, у которых немодифицированный глютен был способен достигать максимального ингибирования примерно на 35%. Это ясно демонстрирует различия между двумя продуктами, указывая на то, что, хотя все эпитопы глютена сохранялись в кислотно-гидролизованном глютене, новые эпитопы дополнительно развивались после кислотного гидролиза. Различия между наивными и толерантными крысами показали, что у толерантных крыс вырабатывается больше антител против эпитопов, не присутствующих в немодифицированном глютене, чем у наивных крыс.

Рис. 8.

IgG ₁ способность двух глютеновых продуктов связывать антитела. a Пулы сыворотки от наивных крыс, которым вводили 500 мкг немодифицированного глютена, а затем иммунизировали, предварительно инкубировали с 10-кратными разведениями немодифицированного или кислотно-гидролизованного глютена. Уровни антител IgG ₁ были слишком низкими для толерантных крыс, которым вводили немодифицированный глютен, для проведения ингибирующего ELISA. b Пулы сыворотки от наивных и толерантных крыс, которым вводили 500 мкг кислотно-гидролизованной глютена, а затем постиммунизировали, предварительно инкубировали с 10-кратными разведениями немодифицированной или кислотно-гидролизованной глютена.Результаты выражаются в процентах ингибирования по отношению к концентрации ингибитора. c Сравнение значений IC ₅₀ из измерений авидности у отдельных крыс после 5 недель нанесения на кожу (день 35) и после 2 пост-иммунизаций (день 49). Авидность тестировали с тем же продуктом, который вводили крысам. d Сравнение значений IC ₅₀ из измерений авидности у отдельных крыс после 2 постиммунизаций. Авидность тестировалась против немодифицированного глютена и глютена, гидролизованного кислотой.Каждый символ представляет 1 животное, а горизонтальная полоса указывает среднее значение. Показаны статистически значимые различия между указанными группами: * p <0,05, ** p <0,01. Un Glu, немодифицированный глютен; Ac Glu, кислотно-гидролизованный глютен.

Сила связывания индуцированных антител оценивалась с помощью ELISA авидности KSCN, который показал, что сила связывания была немного выше после 2 пероральных постиммунизаций (на 49 день), чем после нанесения только на кожу (на 35 день) (рис.8c). Кроме того, можно видеть, что сила связывания антител кислотно-гидролизованной глютена была ниже, чем у немодифицированной глютена, поскольку измерения авидности показали, что более низкий уровень KSCN был необходим для половинного ингибирования связывания с кислотно-гидролизованной глютеном, когда по сравнению с немодифицированным глютеном, независимо от того, какие антитела вырабатывались против немодифицированного или кислотно-гидролизованного глютена (рис. 8c, d). При тестировании антител против немодифицированного глютена и кислотно-гидролизованного глютена по отношению к одним и тем же продуктам из глютена наблюдалась аналогичная авидность (рис.8d), что указывает на то, что антитела, вырабатываемые против немодифицированного глютена и кислотно-гидролизованного глютена, обладают сходной связывающей способностью.

Обсуждение

Крысы BN хорошо известны как крысы с высоким уровнем IgE, которые в некоторой степени напоминают людей с атопией по своей предрасположенности к развитию аллергии, что позволяет исследовать аллергические реакции и механизмы, лежащие в их основе, у этой конкретной линии животных [32 ]. В этом исследовании было показано, что крысы BN предоставили подходящую животную модель для изучения кожной сенсибилизации пищевой аллергии.Немодифицированный и кислотно-гидролизованный глютен был способен сенсибилизировать наивных крыс BN после нанесения на слегка поврежденную кожу, но только кислотно-гидролизованный глютен мог вызвать немного более высокий ответ IgE у толерантных к пшенице крыс BN и в гораздо меньшей степени.

В пилотных исследованиях изучали состояние кожи в зависимости от удаления волос и нанесения продукта. Использование Veet в качестве крема для депиляции показалось эффективным, но произошли нежелательные изменения. Выводы об использовании Veet в качестве крема для депиляции неоднородны.Результаты, представленные Dunkin et al. [33] указали на отсутствие явных изменений кожного барьера при использовании Veet. Аналогичные выводы были сделаны Tordesillas et al. [34], которые подтвердили, что кожа была неповрежденной после применения Veet. Важно изучить состояние кожи, поскольку степень повреждения кожи может сильно повлиять на сенсибилизацию.

В этом исследовании было выполнено механическое разрушение кожи, чтобы напоминать людей с нарушенными барьерными функциями кожи. Изменение кожного барьера может повлиять на сенсибилизацию через кожу, поскольку это может позволить проникновение антигенов, иначе исключенных неповрежденным кожным барьером.Мышиные модели сенсибилизации кожи пищевой аллергией обычно используют скотч, чтобы вызвать механическое повреждение кожи. В этом исследовании не наблюдалось влияния снятия скотча на выбритую кожу, что приводило к царапинам наждачной бумагой. Изменение кожного барьера при атопическом дерматите проявляется в снижении содержания воды в роговом слое и увеличении TEWL [35]. В нашем пилотном исследовании мы наблюдали четкую корреляцию между гистологией кожи и испарением воды при исследовании кожи после царапин и многократного воздействия продуктов.

Нанесение продуктов на кожу с окклюзионными пластырями может повлиять на проницаемость кожи и, таким образом, усилить проникновение аллергена. В нескольких исследованиях на мышах для нанесения аллергенов использовались окклюзионные пластыри. Пластыри оставляли на 24 часа [26, 36] или на более длительный период воздействия, например, на 3 дня [37, 38]. В этом исследовании продукты с глютеном оставляли на коже на 1 час, короткий период воздействия аллергена, аналогичный 40 минутам, использованным в исследовании Wavrin et al. [39].Эти короткие периоды воздействия аллергена могут более точно соответствовать тому, что испытывают потребители, и могут не влиять на проницаемость кожи. Однако трудно сделать вывод о какой-либо строгой корреляции между продолжительностью воздействия аллергена и реакцией сенсибилизации.

В этом исследовании была создана надежная модель на животных для изучения сенсибилизирующей способности 2 различных продуктов с глютеном через кожу. Кислотно-гидролизованный глютен вызывает реакции у людей.Здесь мы показываем различия между двумя продуктами, немодифицированным и кислотно-гидролизованным глютеном, перенесенными на модель крысы BN.

Путем включения сенсибилизации, зависящей от продолжительности и дозы, можно было наблюдать различные степени иммунных ответов, выявляя более высокий риск сенсибилизации, чем выше доза, наносимая на кожу, и тем дольше продолжительность режима дозирования для сенсибилизации.

Сенсибилизирующая способность немодифицированного и кислотно-гидролизованного глютена оценивалась как на наивных, так и на толерантных крысах BN.Наивные крысы напоминают людей с наивной иммунной системой без предварительного контакта с глютеном или перекрестно-реактивными продуктами, в то время как толерантные крысы напоминают людей с установленной пероральной толерантностью к глютену из-за предшествующего перорального воздействия. У неопытных крыс оба продукта были способны вызывать аллергическую сенсибилизацию через кожу, тогда как у толерантных крыс только кислотно-гидролизованный глютен был способен индуцировать специфический IgE. Ранее это было показано в исследовании на мышах Strid et al. [24], что нанесение арахисового белка на кожу способно частично нарушить существующую пероральную толерантность к арахису.Это может коррелировать со случаями из Японии, где аллергические кожные реакции, вызванные кислотно-гидролизованным белком пшеницы, способствовали нарушению пероральной толерантности у лиц, ранее толерантных к пшенице [22, 40]. Эти наблюдения очень хорошо согласуются с нашими результатами.

Оценивая различия в иммунном ответе на 2 продукта глютена, способность связывания антител исследовали с помощью иммуноблоттинга и ингибирующего ELISA объединенной сыворотки крыс, сенсибилизированных немодифицированным или кислотно-гидролизованным глютеном.Результаты ясно показывают, что кислотный гидролиз глютена индуцирует новые эпитопы, сохраняя при этом исходные. Эти результаты согласуются с результатами, представленными Kroghsbo et al. [30], которые обнаружили, что крысы сенсибилизировали i.p. или перорально с кислотно-гидролизованной глютеном развивались специфические ответы IgG ₁ с связывающей способностью, отличной от таковой у крыс, сенсибилизированных немодифицированным глютеном. Это согласуется с данными Denery-Papini et al. [41], которые обнаружили, что у IgE пациентов с аллергией на дезамидированный глютен была самая сильная реакция с эпитопом, в котором 2 или 3 из 4 глутаминов были заменены на глутамат из-за дезамидирования.

Различия в выработке антител против новых эпитопов также могут проявляться у наивных и толерантных крыс. При иммуноблоттинге наблюдались различные паттерны связывания, и более низкая ингибирующая способность немодифицированного глютена наблюдалась у толерантных крыс, которым вводили кислотно-гидролизованный глютен. Кроме того, результаты ELISA на авидность показали, что вновь образованные эпитопы связывают антитела с более низкой авидностью, чем общие эпитопы. В заключение, оба продукта глютена были способны сенсибилизировать через слегка поврежденную кожу у наивных крыс линии BN.Однако результаты показывают, что только кислотно-гидролизованный глютен был способен нарушить уже установленную пероральную переносимость после воздействия на кожу.

Благодарность

Авторы хотели бы поблагодарить Tereos Syral за предоставленные глютеновые продукты, использованные в исследовании. Особая благодарность Джулиане Маргрет Грегерсен и Саре Грундт Симонсен за отличную техническую помощь. Мы также хотели бы поблагодарить Энн Эрнгрин, Майю Даниэльсен, Олафа Дальгаарда, Элиз Навнтофт, Камиллу Нордхейм и Кеннета Ворма за большую помощь в учреждении для животных.

Заявление об этике

Этическое одобрение экспериментов на животных было дано Датской инспекцией экспериментов на животных, а номер разрешения — 2015-15-0201-00553-C1. Эксперименты контролировались внутренним комитетом по защите животных Национального института пищевых продуктов по уходу за животными и их использованию.

Заявление о раскрытии информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Источники финансирования

Работа была поддержана Lundbeckfonden и Датским агентством по охране окружающей среды.

Вклад авторов

A.R.B. участвовал в разработке исследования, лабораторных анализах, анализе данных и написании рукописей. C.B.M. участвовал в разработке исследования, анализе данных, написании рукописи и критическом пересмотре рукописи. К.Л.Б. участвовал в разработке исследования, анализе данных, написании рукописи и критическом пересмотре рукописи. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

Список литературы

1. Наута А.Дж., Энгельс Ф., Книппельс Л.М., Гарссен Дж., Найкамп Ф.П., Редегельд Ф.А.Механизмы аллергии и астмы. Eur J Pharmacol. 2008 Май; 585 (2-3): 354–60.
2. Стэнли С. Оральная переносимость пищи. Curr Allergy Asthma Rep., 2002, январь; 2 (1): 73–7.
3. Сандилендс A, Сазерленд C, Ирвин AD, Маклин WH.Филаггрин на передовой: роль в барьерной функции кожи и заболевании. J Cell Sci. 2009 Май; 122 (Pt 9): 1285–94.
4. Sicherer SH, Sampson HA. Пищевая аллергия: эпидемиология, патогенез, диагностика и лечение. J Allergy Clin Immunol. 2014 Февраль; 133 (2): 291–307.
5. Sicherer SH, Sampson HA.Пищевая гиперчувствительность и атопический дерматит: патофизиология, эпидемиология, диагностика и лечение. J Allergy Clin Immunol. 1999 сентябрь; 104 (3 3 Pt 2): S114–22.
6. Brown SJ, Asai Y, Cordell HJ, Campbell LE, Zhao Y, Liao H и др. Варианты с потерей функции в гене филаггрина являются значительным фактором риска аллергии на арахис.J Allergy Clin Immunol. 2011 Март; 127 (3): 661–7.
7. Hourihane JO, Kilburn SA, Dean P, Warner JO. Клиническая характеристика аллергии на арахис. Clin Exp Allergy. 1997 июн; 27 (6): 634–9.
8. Отсутствие G, Fox D, Northstone K, Golding J; Группа изучения лонгитюдного исследования родителей и детей компании Avon.Факторы, связанные с развитием аллергии на арахис в детстве. N Engl J Med. 2003 Март; 348 (11): 977–85.
9. Кодряну Ф., Мориссет М., Кордебар В., Канни Дж., Монере-Вотрен Д.А. Риск аллергии на пищевые белки в местных лекарственных средствах и косметических средствах. Eur Ann Allergy Clin Immunol.2006 Апрель; 38 (4): 126–30. Доступно по адресу: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16805419
10. Фукутоми Ю., Танигучи М., Накамура Х., Акияма К. Эпидемиологическая связь между аллергией на пшеницу и воздействием гидролизованного белка пшеницы в мыле для лица. Аллергия. 2014 Октябрь; 69 (10): 1405–11.
11. Поотонгкам С, Недорост С.Овес и пшеница как контактные аллергены в средствах личной гигиены. Дерматит. 2013 ноябрь-декабрь; 24 (6): 291–5.
12. Визер Х. Химия белков глютена. Food Microbiol. 2007 Апрель; 24 (2): 115–9.
13. Shewry PR, Halford NG, Lafiandra D.Генетика белков глютена пшеницы. Adv Genet. 2003. 49: 111–84.
14. Wu CH, Nakai S, Powrie WD. Приготовление и свойства клейковины, растворенной в кислоте. J. Agric Food Chem. 1976 Май-июнь; 24 (3): 504–10.
15. День L, Огюстен Массачусетс, Бейти Иллинойс, Ригли CW.Использование пшеничного глютена и потребности промышленности. Trends Food Sci Technol. 2006. 17 (2): 82–90.
16. Варйонен Э., Петман Л., Мякинен-Кильюнен С. Непосредственная контактная аллергия из-за гидролизованной пшеницы в косметическом креме. Аллергия. Март 2000, 55 (3): 294–6. Доступно по адресу: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10753023
17. Laurière M, Pecquet C, Bouchez-Mahiout I, Snégaroff J, Bayrou O, Raison-Peyron N и др.Гидролизованные протеины пшеницы, присутствующие в косметических средствах, могут вызывать немедленную гиперчувствительность. Свяжитесь с Dermat. 2006 Май; 54 (5): 283–9.
18. Bouchez-Mahiout I, Pecquet C, Kerre S, Snégaroff J, Raison-Peyron N, Laurière M. Высокомолекулярные соединения в промышленных гидролизатах белка пшеницы иммунореактивны с IgE от пациентов с аллергией.J. Agric Food Chem. 2010 апр; 58 (7): 4207–15.
19. Пелконен А.С., Мякинен-Кильюнен С., Хилво С., Силтанен М., Мякеля М.Дж. Тяжелая аллергическая реакция на гидролизат глютена без реакции на пшеницу. Ann Allergy Asthma Immunol. 2011 Апрель; 106 (4): 343–4.
20. Шинода Дж., Иномата Н., Чинуки Ю., Морита Е., Икезава З.Случай аллергии из-за гидролизованных белков пшеницы в вареной свинине. J Dermatol. 2012 август; 39 (8): 724–6.
21. Чинуки Ю., Канеко С., Сакеда К., Мурата С., Йошида Ю., Морита Э. Случай анафилаксии, вызванной физическими упражнениями, вызванной пшеницей, сенсибилизированный гидролизованным белком пшеницы в мыле.Свяжитесь с Dermat. Июль 2011 г.; 65 (1): 55–7.
22. Фукутоми Ю., Итагаки Ю., Танигути М., Сайто А., Ясуеда Х., Накадзава Т. и др. Сенсибилизация риноконъюнктивы к гидролизованному белку пшеницы в мыле для лица может вызвать анафилаксию, вызванную физическими упражнениями, зависимую от пшеницы. J Allergy Clin Immunol. 2011; 127: 531–33.
23. Се KY, Цай CC, Wu CH, Lin RH. Эпикутанное воздействие белкового антигена и пищевая аллергия. Clin Exp Allergy. 2003 август; 33 (8): 1067–75.
24. Стрид Дж., Хурихейн Дж., Кимбер И., Каллард Р., Штробель С.Воздействие на кожу арахиса протеина предотвращает пероральную переносимость и усиливает аллергическую сенсибилизацию. Clin Exp Allergy. 2005 июн; 35 (6): 757–66.
25. Бирмингем Н. П., Парватанени С., Хассан Х. М., Харкема Дж., Саминени С., Навулури Л. и др. Модель аллергии на древесный орех на мышах без адъюванта с использованием фундука в качестве модели древесного ореха.Int Arch Allergy Immunol. 2007. 144 (3): 203–10.
26. Parvataneni S, Gonipeta B, Tempelman RJ, Gangur V. Разработка модели мышей с аллергией на орехи кешью без адъюванта. Int Arch Allergy Immunol. 2009. 149 (4): 299–304.
27. Bartnikas LM, Gurish MF, Burton OT, Leisten S, Janssen E, Oettgen HC, et al.Эпикутанная сенсибилизация приводит к IgE-зависимому разрастанию тучных клеток кишечника и анафилаксии, вызванной пищей. J Allergy Clin Immunol. 2013 февраль; 131 (2): 451–60.e1.
28. Адачи Р., Накамура Р., Сакаи С., Фукутоми Ю., Тешима Р. Сенсибилизация к кислотно-гидролизованному белку пшеницы путем трансдермального введения мышам BALB / c и сравнение с глютеном.Аллергия. 2012 ноябрь; 67 (11): 1392–9.
29. Мацунага К., Курода Ю., Сакаи С., Адачи Р., Тешима Р., Ягами А. и др. Анафилактическое увеличение за счет эпикутанной сенсибилизации к кислотно-гидролизованному белку пшеницы на модели морской свинки. J Toxicol Sci. 2015 декабрь; 40 (6): 745–52.
30. Крогсбо С., Андерсен Н. Б., Расмуссен Т. Ф., Якобсен С., Мадсен CB.Кислотный гидролиз глютена пшеницы вызывает образование новых эпитопов, но не увеличивает сенсибилизирующую способность при пероральном введении: исследование на крысах Brown Norway «без глютена». PLoS One. 2014 сентябрь; 9 (9): e107137.
31. Kroghsbo S, Bøgh KL, Rigby NM, Mills EN, Rogers A, Madsen CB. Сенсибилизация 7S-глобулинами из арахиса, фундука, сои или гороха индуцирует IgE с различной биологической активностью, которая изменяется толерантностью сои.Int Arch Allergy Immunol. 2011; 155 (3): 212–24.
32. Книппельс Л.М., Пеннинкс А.Х., Спанхак С.Г., Хубен Г.Ф. Оральная сенсибилизация к пищевым белкам: модель крысы Brown Norway. Clin Exp Allergy. 1998 Март; 28 (3): 368–75.
33. Данкин Д., Берин М.С., Майер Л.Аллергическая сенсибилизация может быть вызвана несколькими физиологическими путями в зависимости от адъюванта. J Allergy Clin Immunol. 2011 декабрь; 128 (6): 1251–1258.e2.
34. Тордесильяс Л., Госвами Р., Бенеде С., Гришина Г., Данкин Д., Ярвинен К. М. и др. Воздействие на кожу способствует Th3-зависимой сенсибилизации к аллергенам арахиса.J Clin Invest. 2014 ноя; 124 (11): 4965–75.
35. Seidenari S, Giusti G. Объективная оценка кожи детей, пораженных атопическим дерматитом: исследование pH, емкости и TEWL в экзематозной и клинически не пораженной коже. Acta Derm Venereol. 1995 Ноябрь; 75 (6): 429–33.
36. Гонипета Б., Парватанени С., Темпельман Р.Дж., Гангур В.Модель мышей без адъюванта для оценки аллергенности молочного сывороточного белка. J Dairy Sci. 2009 Октябрь; 92 (10): 4738–44.
37. Бирмингем Н., Гангур В., Саминени С., Навулури Л., Келли С. Аллергия на лесной орех: доказательства того, что лесной орех может напрямую вызывать специфический ответ антител IgE через активацию цитокинов типа 2 у мышей.Int Arch Allergy Immunol. 2005 Август; 137 (4): 295–302.
38. Навулури Л., Парватанени С., Хассан Х., Бирмингем Н. П., Келли С., Гангур В. Аллергическая и анафилактическая реакция на семена кунжута у мышей: идентификация Ses i 3 и основной субъединицы 11s глобулинов как аллергенов. Int Arch Allergy Immunol.2006. 140: 270–6.
39. Ваврин С., Бернард Х., Уол Дж. М., Адель-Пациент К. Кожное или респираторное воздействие аллергенов арахиса у мышей и их влияние на последующее пероральное воздействие. Int Arch Allergy Immunol. 2014. 164 (3): 189–99.
40. Накамура Р., Накамура Р., Сакаи С., Адачи Р., Хатисука А., Урису А. и др.Тканевая трансглутаминаза генерирует дезамидированные эпитопы глютена, увеличивая реактивность с гидролизованным IgE, сенсибилизированным белком пшеницы. J Allergy Clin Immunol. 2013 декабрь; 132 (6): 1436–8.
41. Денери-Папини С., Бодинье М., Ларре С., Броссар С., Пино Ф., Трибальо С. и др. Аллергия на дезамидированный глютен у пациентов, устойчивых к пшенице: специфические эпитопы, связанные с дезамидированием.Аллергия. 2012 август; 67 (8): 1023–32.

Автор Контакты

Д-р Катрин Линдхольм Бёг

Национальный институт пищевых продуктов, Технический университет Дании

Кемиторвет, дом 202

DK – 2800 кг. Lyngby (Дания)

Эл. Почта [email protected]

Подробности статьи / публикации

Предварительный просмотр первой страницы

Поступила: 26 июня 2018 г.
Дата принятия: 15 сентября 2018 г.
Опубликована онлайн: 5 декабря 2018 г.
Дата выпуска: февраль 2019 г.

Количество страниц для печати: 13
Количество фигур: 8
Количество столов: 0

ISSN: 1018-2438 (печатный)
eISSN: 1423-0097 (онлайн)

Для дополнительной информации: https: // www.karger.com/IAA

Лицензия открытого доступа / Дозировка лекарства / Заявление об ограничении ответственности

Эта статья находится под международной лицензией Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 (CC BY-NC-ND). Использование и распространение в коммерческих целях, а также любое распространение измененных материалов требует письменного разрешения. Дозировка лекарства: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор и дозировка лекарства, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации.Однако ввиду продолжающихся исследований, изменений в правительственных постановлениях и постоянного потока информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на них, читателю настоятельно рекомендуется проверять листок-вкладыш для каждого препарата на предмет любых изменений показаний и дозировки, а также дополнительных предупреждений. и меры предосторожности. Это особенно важно, когда рекомендованным агентом является новый и / или редко применяемый препарат. Отказ от ответственности: утверждения, мнения и данные, содержащиеся в этой публикации, принадлежат исключительно отдельным авторам и соавторам, а не издателям и редакторам.Появление в публикации рекламы и / или ссылок на продукты не является гарантией, одобрением или одобрением рекламируемых продуктов или услуг или их эффективности, качества или безопасности. Издатель и редактор (-ы) не несут ответственности за любой ущерб, нанесенный людям или имуществу в результате любых идей, методов, инструкций или продуктов, упомянутых в контенте или рекламе.

Гиперчувствительность | Микробиология

Цели обучения

• Определите и сравните отличительные характеристики, механизмы и основные примеры гиперчувствительности типов I, II, III и IV

Клиническое направление: Керри, часть 1

Керри, 40-летний пилот авиакомпании, записалась на прием к своему лечащему врачу, чтобы обсудить сыпь, которая появляется, когда она проводит время на солнце.Как она объясняет своему врачу, это не похоже на солнечный ожог. Она старается не проводить слишком много времени на солнце и пользуется солнцезащитным кремом. Несмотря на эти меры предосторожности, сыпь по-прежнему появляется в виде красных приподнятых пятен, которые становятся слегка чешуйчатыми. Сыпь сохраняется каждый раз от 7 до 10 дней и, кажется, проходит сама по себе. В последнее время высыпания стали появляться на ее щеках и над глазами по обе стороны лба.

• Керри права, чтобы волноваться, или ей просто нужно быть осторожнее с солнцем?
• Есть ли условия, которые могут быть вызваны воздействием солнца, которые должен учитывать врач Керри?

В статье «Адаптивная специфическая защита хозяев» мы обсудили механизмы, с помощью которых адаптивная иммунная защита, как гуморальная, так и клеточная, защищает нас от инфекционных заболеваний.Однако эти же защитные иммунные защиты также могут быть ответственны за нежелательные реакции, называемые реакциями гиперчувствительности . Реакции гиперчувствительности классифицируются по их иммунному механизму.

• Реакции гиперчувствительности I типа включают антитело иммуноглобулина E (IgE) против растворимого антигена, вызывая дегрануляцию тучных клеток.
• Реакции гиперчувствительности типа II включают антитела IgG и IgM, направленные против клеточных антигенов, что приводит к повреждению клеток, опосредованному другими эффекторами иммунной системы.
• Реакции гиперчувствительности III типа связаны с взаимодействием антител IgG, IgM и, иногда, антител IgA ¹ с антигеном с образованием иммунных комплексов. Накопление иммунных комплексов в ткани приводит к повреждению ткани, опосредованному другими эффекторами иммунной системы.
• Реакции гиперчувствительности IV типа — это реакции, опосредованные Т-клетками, которые могут включать повреждение тканей, опосредованное активированными макрофагами и цитотоксическими Т-клетками.

Гиперчувствительность I типа

Когда пресенсибилизированный человек подвергается воздействию аллергена , это может привести к быстрому иммунному ответу, который возникает почти сразу.Такой ответ называется аллергией и классифицируется как гиперчувствительность типа I . Аллергенами могут быть, казалось бы, безвредные вещества, такие как шерсть животных, плесень или пыльца. Аллергенами также могут быть вещества, которые изначально считаются более опасными, например, яд насекомых или терапевтические препараты. Пищевая непереносимость также может вызывать аллергические реакции, поскольку люди становятся сенсибилизированными к таким продуктам, как арахис или моллюски. Независимо от аллергена, первое воздействие активирует ответ первичных антител IgE, который повышает чувствительность человека к реакции гиперчувствительности I типа при последующем воздействии.

Рис. 1. (a) Аллергены в пыльце растений, показанные здесь на цветной электронной микрофотографии, могут вызывать аллергический ринит или сенную лихорадку у чувствительных людей. (б) Кожные высыпания часто связаны с аллергическими реакциями. (c) Арахис может быть безопасно употреблен в пищу большинством людей, но может вызвать серьезные аллергические реакции у чувствительных людей.

У восприимчивых людей первое воздействие аллергена активирует сильный ответ клеток T _H 2. Цитокины интерлейкин (ИЛ) -4 и ИЛ-13 из клеток T _H 2 активируют В-клетки, специфичные к одному и тому же аллергену, что приводит к клональной пролиферации, дифференцировке в плазматические клетки и переключению класса антител с продукции IgM на продукцию IgE .Фрагменты кристаллизующихся (Fc) областей антител IgE связываются со специфическими рецепторами на поверхности тучных клеток по всему телу. Подсчитано, что каждая тучная клетка может связывать до 500000 молекул IgE, при этом каждая молекула IgE имеет два антигенсвязывающих (Fab) сайта аллергенспецифических фрагментов, доступных для связывания аллергена при последующих воздействиях. К тому времени, когда это происходит, аллерген часто уже отсутствует и аллергическая реакция отсутствует, но тучные клетки подготовлены к последующему воздействию, и человек становится сенсибилизированным к аллергену.

При последующем воздействии аллергены связываются с множеством молекул IgE на тучных клетках, перекрестно связывая молекулы IgE. В течение нескольких минут это перекрестное связывание IgE активирует тучные клетки и запускает дегрануляцию , реакцию, при которой содержимое гранул тучной клетки высвобождается во внеклеточную среду. Предварительно сформированные компоненты, которые высвобождаются из гранул , включают гистамин , серотонин и брадикинин .Активированные тучные клетки также высвобождают вновь образованные липидные медиаторы ( лейкотриенов и простагландинов из мембранного метаболизма арахадоновой кислоты ) и цитокинов , таких как фактор некроза опухоли .

Химические медиаторы, выделяемые тучными клетками, в совокупности вызывают воспаление, а также признаки и симптомы, связанные с реакциями гиперчувствительности I типа. Гистамин стимулирует секрецию слизи в носовых проходах и образование слезы из слезных желез, вызывая насморк и слезотечение при аллергии.Взаимодействие гистамина с нервными окончаниями вызывает зуд и чихание. Расширение сосудов, вызванное несколькими медиаторами, может привести к крапивнице, головным болям, ангионевротическому отеку (отеку, который часто поражает губы, горло и язык) и гипотонии (низкому кровяному давлению). Сужение бронхиол, вызванное некоторыми химическими медиаторами, приводит к хрипу, одышке (затрудненное дыхание), кашлю и, в более тяжелых случаях, цианозу (синеватый цвет кожи или слизистых оболочек).Рвота может быть результатом стимуляции рвотного центра мозжечка гистамином и серотонином. Гистамин также может вызывать расслабление гладкой мускулатуры кишечника и диарею.

Рисунок 2.При первом контакте с аллергеном у восприимчивого индивидуума антигенпрезентирующие клетки обрабатывают и представляют эпитопы аллергена с главным комплексом гистосовместимости (MHC) II Т-хелперам. В-клетки также обрабатывают и представляют тот же эпитоп аллергена для клеток Th3, которые высвобождают цитокины IL-4 и IL-13, чтобы стимулировать пролиферацию и дифференцировку в плазматические клетки, секретирующие IgE. Молекулы IgE связываются с тучными клетками с их областью Fc, сенсибилизируя тучные клетки для активации с последующим воздействием аллергена.При каждом последующем воздействии аллерген связывает молекулы IgE на тучных клетках, активируя тучные клетки и вызывая высвобождение предварительно сформированных химических медиаторов из гранул ( дегрануляция ), а также вновь образованных химических медиаторов, которые в совокупности вызывают признаки и симптомы реакций гиперчувствительности I типа.