Содержание

ЛНП — это… Что такое ЛНП?

  • ЛНП — Липопротеины низкой плотности (ЛПНП, ЛНП, англ. Low density lipoprotein, LDL)  класс липопротеинов крови, являющийся наиболее атерогенным. ЛПНП образуются из липопротеинов очень низкой плотности в процессе липолиза. Этот класс липопротеинов… …   Википедия

  • ЛНП — Либеральная народная партия (Финляндия) Либеральная независимая партия (Никарагуа) липопротеид низкой плотности ложный наблюдательный пункт …   Словарь сокращений русского языка

  • АТЕРОСКЛЕРОЗ — мед. Атеросклероз системное заболевание, поражающее арте рнн эластического (аорта и её ветви) и мышечно эластическо го (артерии сердца, головного мозга и др.) типов. При этом во внутренней оболочке артериальных сосудов формируются очаги лиИидных …   Справочник по болезням

  • Атеросклероз — I Атеросклероз Атеросклероз (atherosclerosis, греч. athērē кашица + sklērōsis уплотнение, затвердение) распространенное хроническое заболевание, характеризующееся возникновением в стенках артерий очагов липидной инфильтрации и разрастания… …   Медицинская энциклопедия

  • Липопротеины — Липопротеины. Структура Липопротеины (липопротеиды)  класс сложных белков, простетическая группа которых представлена каким либо липидом. Так, в составе липопротеинов могут быть свободные …   Википедия

  • Аполипопротеины — (устаревшее аполипопротеиды) это белковые, как правило амфифильные, составляющие липопротеинов, специфически связывающиеся с соответствующими липидами при формировании липопротеиновой частицы[1]. Например, существует несколько разновидностей… …   Википедия

  • ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИЯ — мед. Гиперхолестеринемия (ГХ) повышение содержания холестерина в сыворотке более 200 мг/дл (5,18 ммоль/л). Один из основных факторов риска атеросклероза. Частота. У 120 млн людей отмечено содержание холестерина в крови 200 мг% (5,18 ммоль/л) и… …   Справочник по болезням

  • ЛИПОПРОТЕИНЫ — (липопротеиды), комплексы, состоящие из белков (аполипопротеинов; сокращенно апо Л.) и липидов, связь между к рыми осуществляется посредством гидрофобных и электростатич. взаимодействий. Л. подразделяют на свободные, или р римые в воде (Л. плазмы …   Химическая энциклопедия

  • ДЕФЕКТЫ АПОЛИПОПРОТЕИНОВ — мед. Аполипопротеины (апоЛП) белковая часть липопротеинов, формирующих липопротеины высокой плотности (ЛВП), липо протеины низкой плотности (ЛНП), липопротеины очень низкой плотности (ЛОНП) и хиломикроны плазмы. Различают 8 основных типов апоЛП A …   Справочник по болезням

  • Холестерин, Холестерол (Cholesterol) — липид (стерол), присутствующий в крови и большинстве тканей человеческого тела, особенно в нервной ткани. Холестерин и его производные являются важной составной частью клеточных мембран, основой многих стероидных гормонов и желчных солей.… …   Медицинские термины

  • Анализы крови на Холестерин липопротеидов низкой плотности в KDL.

    Липопротеины низкой плотности (ЛПНП, LDL-С) являются одной из транспортнывх форм переноса липидов. Их часто называют «плохим» холестерином, поскольку они способствуют отложению его излишков на стенках кровеносных сосудов, что приводит к атеросклерозу и сердечно-сосудистым патологиям. Обратному процессу способствуют липопротеины высокой плотности (ЛПВП, HDL-C), которые транспортируют холестерин в печень, где он перерабатывается. Уровень ЛПНП лучше коррелирует с риском развития атеросклероза, чем уровень общего холестерина

    В каких случаях обычно назначают исследование?

    Тест на липопротеины низкой плотности входит в исследования «Липидный профиль, базовый» и «Липидный профиль расширенный». Оба комплексных лабораторных теста используются для скрининга нарушений обмена липидов и определения рисков развития сердечно-сосудистых заболеваний.

    Оценка уровня ЛПНП важна у пациентов с нарушениями липидного обмена

    Анализ является обязательным при наличии факторов риска атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний. К факторам риска относятся: семейная история ишемической болезни сердца (ИБС), гипертония, курение, ожирение, сахарный диабет и низкий уровень холестерина ЛПВП.

     

    Высокий уровень ЛПВП (липопротеинов высокой плотности, HDL-C) считается благоприятным фактором, уменьшающим риск.

    Что именно определяется в процессе анализа?

    Уровень ЛПНП в сыворотке крови определяется колориметрическим методом. У пациентов с крайне высоким уровнем триглицеридов, а также у пациентов с семейной гиперлипопротеинемией III типа значения ЛПНП могут быть искажены.

    Что означают результаты теста?

    Нормальный уровень липидов в целом помогает поддерживать здоровье сердечно-сосудистой системы и снижает шансы развития заболеваний. Лечащий врач будет принимать во внимание результаты LDL-C и других компонентов липидного профиля, а также иные факторы риска, чтобы определить общую вероятность развития сердечно-сосудистых заболеваний у пациента, независимо от того, требуется ли лечение и, если нужно, подобрать наиболее эффективную программу терапии.

    Согласно NCEP ( National Cholesterol Education Program) , если у человека нет других факторов риска, содержание LDL-C можно оценить следующим образом:

    • менее 2,6 ммоль/л) – оптимальное значение;
    • 2,6-3,3 ммоль/л – близкое к оптимальному;
    • 3,4-4,1 ммоль/л – пограничное;
    • 4,1-4,90 ммоль/л – высокое;
    • более 4,90 ммоль/л — очень высокое.

    Целевые значения для LDL-C могут меняться в зависимости от индивидуальных особенностей пациента. Изменение образа жизни (диета, физические упражнения) рекомендуется в качестве лечения для умеренно повышенного содержания ЛПНП. Определенные комбинации значений LDL-C и отдельных факторов риска требуют лечения статинами для снижения уровня холестерина в сочетании с изменением образа жизни.

    Низкая концентрация ЛПНП обычно не вызывает беспокойства у врачей, однако такой результат может наблюдаться у людей с наследственным дефицитом липопротеидов (гипобеталипопротеинемия), гипертиреозом, инфекционно-воспалительными процессами или циррозом печени.

    Сроки выполнения теста.

    Обычно результат можно получить уже на следующий день.

    Как подготовиться к анализу?

    Кровь надо сдавать натощак. Подробнее в разделе «Подготовка».

    Холестерин лпнп — норма содержания в крови. Как сдавать анализ на холестерин

    Такое вещество, как холестерин, защищает внутриклеточные структуры от воздействия свободных радикалов. Разрушающее воздействие последних может привести к болезням. Когда у человека нормальный уровень холестерина, никаких патологий не возникает. Как определяют его повышение или понижение?

    Холестерин является представителем группы стероидов. Кровь содержит его в составе соединений с белками, которые выполняют транспортную функцию. Такое сочетание и называется липопротеинами или липопротеидами. Небольшая часть этого вещества все же является свободным. Такой холестерин считается общим — он не играет определяющую роль при развитии ишемии сердца и других патологий, связанных с сердечно-сосудистой системой. Среди более важных форм холестерина выделяют:

    Около 70% всего количества холестерина, который содержит плазма крови, относится к ЛПНП. Характеризуется он тем, что способен более долго, по сравнению с ЛПВП, задерживаться на стенках сосудов. По этой причине повышение содержания такого холестерола ведет к чрезмерному накоплению в виде атеросклеротических бляшек и различным заболеваниям, касающимся сердечно-сосудистой системы.

     

    Анализ крови на холестерин и липидный спектр

    Если направление от врача включает такое слово, как липидограмма, значит вам назначили:

    •          анализ крови на общий холестерин;

    •          исследование липопротеидов низкой плотности;

    •          исследование липопротеидов высокой плотности;

    •          анализ на триглицериды.

    На основе расшифровки проведенного исследования врач располагает важными показателями, которые помогут ему оценить состояние пациента, а также определить характер протекания или риск развития болезней печени, почек, сердца или аутоиммунных патологий. Анализ крови только на холестерол не несет столько сведений, как липидограмма, поэтому используется только при определении эффективности лечения.

    ВАЖНО:

    Вредный ХОЛЕСТЕРИН в 89% случаев становиться первой причиной инфарктов и инсультов!

    Как правильно сдать анализ на холестерин

    Для достоверности результата анализ требует правильной подготовки, которая показана детям и взрослым. Рекомендуемое время для забора крови из вены — утро. Сам анализ сдается натощак, а накануне лучше исключить физические нагрузки и жирную пищу. Сделать его можно в биохимической лаборатории. Врачи рекомендуют 1 раз за 5 лет обращаться за таким анализом, а после 40 лет лучше проводить каждый год.

    Норма холестерина в крови

    Липидограмма отражает несколько показателей:

    •          уровень общего холестерола — ОХС;

    •          содержание холестерина ЛПВП — ХС ЛПВП;

    •          количество холестерина ЛПНП — ХС ЛПНП;

    •          уровень триглицеридов — ТГ;

    •          индекс атерогенности — КА или ИА.

    Измеряется уровень холестерина ЛПНП и ЛПВП и триглицеридов в мМоль/л. Число общего должно находиться между значениями 3,5 и 5.2 мМоль/л. Поводом для беспокойства является повышение до 6,2 мМоль/л. Содержание холестерина в крови вычисляется так: определяется ХС ЛПВП, уровень которого должен начинаться от 1,4 мМоль/л, а затем при помощи вычитания этого числа из ОХС высчитывается ХС ЛПНП. Количество последнего является нормальным, если оно < 4 мМоль/л. Число триглицеридов не должно превышать значения в 1,5 мМоль/л. Допустимым является количество в 2.3 мМоль/л.

    У женщин

    Холестерин ЛПНП и остальные показатели у женщин будут отличаться. Количество общего должно быть в границах 2,9-7,85 мМоль/л. Все зависит от возраста. Норма ЛПНП у женщин после 50 лет составляет 2,28-5,72 мМоль/л, а в более молодом возрасте — 1,76-4,82 мМоль/л. Те же показатели, только для холестерола ЛПВП составляют 0,96-2,38 мМоль/л и 0,93-2,25 мМоль/л.

    У мужчин

    Количество холестерина ЛПНП в мужском организме приемлемо, если его значение не выходит за границы от 2,02 до 4,79 мМоль/л. Уровень ЛПВП немного отличается и составляет 0.98-1,91 мМоль/л. который характерен для мужчин до 50 лет. В более зрелом возрасте это значение изменяется в пределах от 0,72 до 1,94 мМоль/л. Показатель общего холестерола должен находиться в границах от 3,6 до 6.5 мМоль/л.

    У детей

    Для детского в возрасте 5-10 лет организма нормой холестелора ЛПНП считается значение от 1,63 до 3,63 мМоль/л. У ребенка 10-15 лет это значение практически не изменяется и составляет от 1,66 до 3,52 в тех же единицах. Для возраста 15-18 лет количество холестерола ЛПНП должно быть в рамках от 1,61 до 3,55 мМоль/л. Некоторые

    отклонения возможны в зависимости от пола ребенка: у девочек уровень чуть выше, чем у мальчиков.

    Коэффициент атерогенности

    1.      Если КА меньше 3, то развитие атеросклероза имеет минимальный риск.

    2.      Если КА находится в границах от 3 до 4, то вероятность развития атеросклероза или ишемии сердца высока.

    3.      Если КА больше 5, то риск появления атеросклероза самый высокий. Кроме того, могут развиться сосудистые патологии, заболевания головного мозга, сердца, почек или конечностей.

    Что делать, если холестерин ЛПНП повышен или понижен

    Если холестерин выше нормы, то причинами этому могут быть:

    •          патологии печени;

    •          эндокринные заболевания, например, сахарный диабет;

    •          нарушения метаболизма;

    •          курение и чрезмерное употребления алкоголя;

    •          ожирение;

    •          несбалансированный рацион;

    •          малоподвижный образ жизни;

    •          повышенное артериальное давление.

    Исправить ситуацию и привести холестерол в норму можно при помощи специальной диеты, физических нагрузок и медикаментозных препаратов. Последние начинают принимать уже в более тяжелых случаях. В качестве спортивных нагрузок могут быть короткие пробежки или прогулки пешком. Что касается вкусовых пристрастий, то отказаться придется от:

    •         твердых сортов сыра;

    •         майонеза и других жирных заправок;

    •         колбасных изделий;

    •         выпечки и кондитерских изделий;

    •         сливок, сметаны;

    •         полуфабрикатов;

    •         растительных масел;

    •         мяса жирных сортов.

    Вместо них нужно употреблять свежевыжатые соки, фрукты и овощи в свежем виде, морскую рыбу, особенно лосось и сардину. Готовить пищу лучше посредством запекания или варки на пару. Из напитков снизить холестерол способен зеленый чай. С этой функцией справится и вино, только красное и в разумных дозах. Понижение ЛПНП является следствием низкокалорийных диет, поэтому, кроме диеты, не требует специального лечения.

    Почему НЛП это фикция | Дежурный сектовед

    Белорусский «Институт Современного НЛП» даёт такое определение феномена «Нейролингвистического программирования»:

    «НЛП – искусство и наука о совершенстве, результат исследования того, как выдающиеся люди в различных областях своей деятельности достигают наивысших результатов. НЛП – способ эффективно мыслить и действовать в этом мире. Тренинги НЛП позволяют исследовать то, КАК люди думают и о тех изменениях, которые оказываются возможными». Источник

    Глава тренингового центра «Азбука НЛП» Михаил Дернаковский предлагает следующее определение:

    «НЛП – направление практической психологии, изучающее структуру субъективного опыта человека, разрабатывающее технологии моделирования людей, успешных в какой-либо области и использующее эти модели».

    В тренинговой группе «Дао НЛП» мне пояснили следующее:

    «НЛП – это моделирование. Моделирование навыков <…> НЛП – это просто бренд, название, которое у всех на устах и в книжках. НЛП не научно. Все делается в рамках поведенческого моделирования, не залазя в глубокие дебри науки. Например, мы взяли людей КВН-щиков и расспрашивали, как они придумывают шутки, потом сами стали сочинять шутки. Потом стали обучать на курсе “Юморология”. Вот это и есть суть НЛП».

    Итак, три белорусских НЛП-центра высказывают три разных мнения: это сфера науки («направление практической психологии»), это вне научная сфера (обывательская попытка найти в поведении мастеров модели для подражания), это одновременно и научный и вне научный феномен («искусство и наука о совершенстве»).

    Куда более однозначна английская Википедия /1/:

    «В начале 1980-х годов НЛП рекламировалось как важный прогресс в психотерапии и консультировании, и привлекло некоторый интерес к консультационным исследованиям и клинической психологии. Однако, поскольку контролируемые испытания не показали никакой пользы от НЛП, и его сторонники заявляли все более сомнительные претензии, научный интерес к НЛП исчез /2/. Многочисленные обзоры литературы и метаанализы не выявили доказательств верности утверждений НЛП или эффективности его в качестве терапевтического метода.

    Хотя некоторые НЛП-практики утверждали, что отсутствие эмпирической поддержки связано с недостаточным исследовательским тестированием НЛП, консенсусное научное мнение заключается в том, что НЛП является лженаукой и что попытки отклонить результаты исследований на основе этих аргументов «[Являются] признанием того, что НЛП не располагает доказательной базой и что практикующие НЛП ищут постсоветский авторитет» /3/. Исследования в академическом сообществе показали, что НЛП широко дискредитировано среди ученых /4/. Среди причин для рассмотрения НЛП как псевдонауки тот факт, что доказательства в его пользу ограничены анекдотами (неподтверждёнными историями) и личными свидетельствами /5/, что оно не снабжено научным пониманием нейронауки и лингвистики /6/ и что название “Нейролингвистическое программирование» использует слова научного арго, чтобы произвести впечатление на читателей и запутать идеи, тогда как НЛП само по себе не связывает никаких явлений с нервными структурами и не имеет ничего общего с лингвистикой или программированием /7/. Фактически, в образовании НЛП используется в качестве ключевого примера лженауки /8/».

    Итак, в мире науки после многочисленных академических исследований споров о статусе НЛП нет: это классическая лженаука, эффективность собственных методов которой не превышает эффективность «плацебо» или самовнушения. Не удивительно, что контрольные органы Великобритании запретили в рекламе представлять НЛП как науку.

    С другой стороны, НЛП использует ряд методик, взятых из действительно научных направлений, только под другими именами. Например, создание условных рефлексов или обусловливание (привет академику Павлову и американскому бихевиоризму) продаётся в НЛП под именем техники «якорения». Однако вследствие искажённого понимания научных предпосылок и встраивания в контекст собственной оторванной от реальности мифологии эффективность «анкерования» ниже, чем обусловливания в когнитивно-поведенческой терапии.

    Не выдерживает критики и апелляция НЛП-практиков к лингвистике и психолингвистике. Заслуженный профессор психолингвистики (Университет Неймегена имени святого Радбода Утрехтского) и бывший директор Института по психолингвистике Макса Планка (Нидерланды) Вилем Левельт считает, что НЛП не информировано о лингвистической литературе, оно основано на размытых представлениях, которые давно устарели, концепции лингвистики им не были правильно истолкованы или являются просто измышлениями, а выводы основаны на неправильных предпосылках. Теория и практика НЛП не имеют ничего общего ни с нейрофизиологическими знаниями или лингвистикой, ни с информатикой, ни с теорией программирования /9/.

    Не подтверждаются исследованиями и ключевые практические предпосылки НЛП относительно предпочитаемой репрезентативной системы и сигналов глазного доступа /10/.

    Даже та упрощённая модель билатеральной структуры психики, которая используется в методиках НЛП-культа, не соответствует современным экспериментальным данным /11/. Например, выяснилось, что функциональная асимметрия работы головного мозга носит не глобальный, а парциальный характер. Выделяют моторные асимметрии (мануальную, ножную, оральную, глазодвигательную и т. д.), сенсорные (зрительную, слуховую, тактильную) и психические (асимметрия организации речи и других психических функций). В разных системах характер функциональной асимметрии может быть неодинаков. Каждая конкретная форма функциональной асимметрии отличается своей степенью, мерой выраженности. Можно говорить о сильной или слабой асимметрии. Функциональная асимметрия больших полушарий у взрослого человека это продукт действия биосоциальных структур. Как показали исследования, проведенные на детях, основы функциональной специализации являются врожденными, но по мере развития ребенка происходит усовершенствование и усложнение механизмов межполушарной асимметрии и межполушарного взаимодействия /12/.

    Многие, впрочем, готовы мириться с не научностью НЛП ради тех якобы выдающихся результатов, которые оно даёт на практике. Но и практическая эффективность НЛП опровергнута исследованиями. Так, в докладе 1998 года Национальный Комитет по науке США (The National Science Foundation; NSF) обобщил данные научных исследований:

    «Ни индивидуально, ни в группах эти исследования не смогли обеспечить эмпирически обоснованные доводы в поддержку выдвигаемых НЛП предположений… и эффективности НЛП. Комитет не может рекомендовать практическое применение такой техники, состоятельность которой не подтверждается на практике».

    А Национальный Совет по Борьбе с Мошенничеством в Сфере Здравоохранения (The National Council Against Health Fraud) называет НЛП “сомнительной терапией” (“dubious therapy”). По-солдатски прямо высказался технический директор Армейского Исследовательского Института (Army Research Institute) Эдгар Джонсон (Edgar Johnson), возглавлявший Проект Jedi по проблемам НЛП: «Многие данные свидетельствуют: НЛП не работает».

    В одном исследовании было показано, что техники НЛП снижают тревогу не более эффективно, чем простое ожидание в течение часа /13/.

    Другой исследователь пишет:

    «Это исследование сравнило методы НЛП типа ведения, метафоры и фонематических схем с двумя намного более простыми не-НЛП контролируемыми условиями: директивно-информирующее условие и только информирующее плацебо-условие. Никакие различия в аттитюдах не были найдены среди условий, но не-НЛП директивно-информирующее контролируемое условие продемонстрировало значительно большую убедительность в поведенческой системе измерения, показав результат, противоположный предсказанному практикующими НЛП» /14/.

    Плачевно для НЛП закончилось и исследование Фромма и Дэниеля:

    «Выявились значительные взаимные корреляции (колеблющиеся около r =0,7) между поведением субъекта в различных сенсорных модальностях, что является единственно возможным результатом, который не был предсказан НЛП» /15/.

    Таким образом, НЛП не представляет ни научной, ни практической ценности.

    Отчасти из-за юридических споров вокруг бренда «НЛП», отчасти из-за попытки дистанцироваться от дискредитирующих исследований на рынке НЛП-практик появились новые марки, такие как «Новый код НЛП», ЕСВ (Единая Структура Воздействия), «НЛП-3», NHR /16/, DHE /17/. В действительности это те же паранаучные идеи и технологии сомнительной эффективности, только в новой упаковке.

    Тем не менее НЛП существует как успешный коммерческий продукт со всеми чертами псевдопсихологического, псевдонаучного клиентурного культа, хорошо продаваемый за счёт того, что сулит невероятный успех почти во всех сферах человеческой жизни: в бизнесе, человеческих отношениях, в психотерапии… в соблазнении и интимной жизни. И всё это в наукоподобной упаковке, украшенной субъективными положительными свидетельствами вымышленных и реальных НЛП-культистов.

    Представления о невероятной эффективности НЛП-технологий живут в сознании обывателей за счёт широкой пропаганды в масс-медиа соответствующих культовых мифов. Ситуация схожа с убеждённостью большинства в высокой эффективности сектантских вербовщиков, владеющих, якобы, почти неодолимыми технологиями порабощения сознания. В действительности же статистические данные говорят о малой эффективности вербовочных мероприятий даже в самых нашумевших культах и сектах и о достаточно серьёзной «текучке» среди членов /18/. НЛП-продавцы иногда паразитируют на предубеждениях обывателей и не отказывают себе в удовольствии заявить, что в сектах и культах используются НЛП-технологии.

    Помимо прочего, многие антропологи и социологи классифицируют НЛП как квазирелигию в рамках движения «Новый век» (New Age) или «Движения человеческого потенциала» /19/.

    Медицинский антрополог Жан М. Лэнгфорд классифицирует НЛП как форму народной магии, т.е. практики с символической эффективностью (против физической эффективности), приводящей к изменениям через неспецифические эффекты (например, плацебо).

    Для него это подобие синкретической народной религии, «которая пытается вывести магию народной практики в науку о профессиональной медицине» /20/.

    Известно, что основатели НЛП Бендлер и Гриндер находились под влиянием шаманизма, описанного в книгах Карлоса Кастанеды /21/. Поэтому некоторые идеи, включённые в НЛП, заимствованы у него. Это касается, например, «двойной индукции» /22/ и «остановки мира» /23/.

    Некоторые авторы классифицируют НЛП как разновидность психорелигиозного культа, в котором происходит подмена монотеистического Бога бессознательным. Если в монотеистических практиках положительная трансформация личности возможна только с опорой на поддержку трансцендентного Бога, то в НЛП и подобных практиках фокус сосредоточен на собственном бессознательном, которое в культовом мифе преподносится как источник невероятного потенциала для самотрансформации и саморазвития /24/.

    Православные авторы чаще всего критикуют НЛП за утилитарный взгляд на ближнего. Модель мышления, формируемая НЛП-курсами, приучает видеть в других людях не цели, а средства для достижения личных целей и пытаться манипулировать ими. Между тем, инструментально-манипулятивное отношение к личности неприемлемо с позиции христианской нравственности.

    Второй несовместимой с православием пресуппозицией НЛП является отрицание истинных и ложных картин мира. Догмат НЛП-культа: «Карта – не территория», извращает мысль Альфреда Коржибского и перетолковывает в том смысле, что любая внутренняя картина мира субъективна, не отражает реальности, да и не должна. Создавать свою картину мира имеет смысл не по критериям соотнесения с реальностью, не по оценке истинности и ложности, но только по критериям утилитарной пользы и эффективности. При создании «Нового кода НЛП» Джон Гриндер и Кармен Бостик зашли ещё дальше – до абсолютного солипсизма: «Мы полагаем, что Коржибский был излишне консервативен, когда сказал, что карта – это не территория. На самом деле мы предполагаем, что и территория – это тоже не территория» /25/.

    Для Альфреда Коржибского «карта – не территория» означает, что описание реальности не есть сама реальность. Но в то же время он настаивает, что карта может обладать структурой, схожей или несхожей со структурой территории /26/. Но в догматике НЛП-культа соответствие карты реальности вообще перестаёт играть какую-либо роль. Парадоксальным образом догмат: «Карта – не территория» превращается в солипсическую тюрьму личности, для которой реальны и значимы лишь собственные «карты». С одной стороны, личность получает свободу на своё усмотрение перерисовывать такое оторванное от объективной реальности полотно мира. А с другой эти воображаемые карты и превращаются в единственную территорию бытия. Таким образом, в НЛП де-факто карта тождественна территории.

    Ещё одно непримиримое противоречие с православной традицией — требование безраздельного доверия бессознательному. Согласно доктрине НЛП-культа, бессознательное лучше сознательного «я» знает, что нужно и полезно человеку. Однако по данным православной аскетики именно в сфере бессознательного укоренены страсти. И техники трезвения и «мысленной брани» как раз направлены на рефлексию и нравственный «просев» того, что всплывает из глубин бессознательного /27/.

    Примечания

    /1/ Перевод с английского Олега Нагорного.

    /2/ 1. Devilly, Grant J. (1 June 2005). “Power Therapies and possible threats to the science of psychology and psychiatry”. Australian and New Zealand Journal of Psychiatry. 39 (6): 437–445. 2. Gelso, C J; Fassinger, R E (1 January 1990). “Counseling Psychology: Theory and Research on Interventions”. Annual Review of Psychology. 41 (1): 355–386.

    /3/ Roderique-Davies, G. (2009). “Neuro-linguistic programming: Cargo cult psychology?”. Journal of Applied Research in Higher Education. 1 (2): 58–63.

    /4/ 1. Norcross, John C.; Koocher, Gerald P.; Garofalo, Ariele (1 January 2006). “Discredited psychological treatments and tests: A Delphi poll.”. Professional Psychology: Research and Practice. 37 (5): 515–522. 2. Norcross, John C.; Koocher, Gerald P.; Fala, Natalie C.; Wexler, Harry K. (1 September 2010). “What Does Not Work? Expert Consensus on Discredited Treatments in the Addictions”. Journal of Addiction Medicine. 4 (3): 174–180. 3. Glasner-Edwards, Suzette; Rawson, Richard (1 October 2010). “Evidence-based practices in addiction treatment: Review and recommendations for public policy“. Health Policy. 97 (2–3): 93–104.

    /5/ 1. Biedermann, Heinz-Joachim; Bradley, E. Jane (1 January 1985). “Bandler and Grinder’s neurolinguistic programming: Its historical context and contribution.”. Psychotherapy: Theory, Research, Practice, Training. APA. 22 (1): 59–62. 2. Tye, Marcus J.C. (1994). “Neurolinguistic programming: Magic or myth?”. Journal of Accelerative Learning & Teaching. 19 (3–4): 309–342.

    /6/ 1. Biedermann, Heinz-Joachim; Bradley, E. Jane (1 January 1985). “Bandler and Grinder’s neurolinguistic programming: Its historical context and contribution.”. Psychotherapy: Theory, Research, Practice, Training. APA. 22 (1): 59–62. 2. Levelt, Willem J.M (1996). “Hoedt u voor neuro-linguistische programmering”. Skepter (in Dutch). Skepsis. 9 (3).

    /7/ 1.Witkowski, Tomasz (1 January 2010). “Thirty-Five Years of Research on Neuro-Linguistic Programming. NLP Research Data Base. State of the Art or Pseudoscientific Decoration?”. Polish Psychological Bulletin. 41 (2). 2. Corballis, M.C. (1999). “Are we in our right minds?”. In S.D. Sala. Mind Myths: Exploring Popular Assumptions About the Mind and Brain (Repr. ed.). Chichester, UK: John Wiley & Sons. p. 41. 3. Drenth, Pieter J.D (2003). “Growing anti-intellectualism in Europe; a menace to science”. Studia Psychologica. 45: 5–13. 4. Beyerstein, B.L (1990). “Brainscams: Neuromythologies of the New Age”. International Journal of Mental Health. 19 (3): 27–36 (27). 5. Weisberg, D. S.; Keil, F. C.; Goodstein, J.; Rawson, E.; Gray, J. R. (2008). “The Seductive Allure of Neuroscience Explanations”. Journal of Cognitive Neuroscience. 20 (3): 470–7.

    /8/ 1. Lum.C (2001). Scientific Thinking in Speech and Language Therapy. Psychology Press. p. 16. 2. Lilienfeld, Scott O.; Lohr, Jeffrey M.; Morier, Dean (1 July 2001). “The Teaching of Courses in the Science and Pseudoscience of Psychology: Useful Resources”. Teaching of Psychology. 28 (3): 182–191. 3. Dunn D, Halonen J, Smith R (2008). Teaching Critical Thinking in Psychology. Wiley-Blackwell. p. 12.

    /9/ 1. Levelt, Willem J.M (1996). “Hoedt u voor neuro-linguistische programmering”. Skepter (in Dutch). Skepsis. 9 (3). 2. Winkin Y 1990 Eléments pour un procès de la P.N.L., MédiAnalyses, no. 7, septembre, 1990, pp. 43-50.

    /10/ «По мере того, как НЛП становилась все более популярной, были проведены некоторые исследования, и обзоры таких исследований пришли к выводу, что нет научной основы для её теорий о репрезентативных системах и движениях глаз». Thyer, Bruce A.; Pignotti, Monica G. (2015-05-15). Science and Pseudoscience in Social Work Practice. Springer Publishing Company. pp. 56–57, 165–167. (Перевод с англ. Олега Нагорного)

    /11/ 1. Еремеева В. Д. Типы латеральности у детей и нейрофизиологические основы индивидуальной обучаемости // Вопр. психол,- 1989.-№6.-С. 128-135. 2. Деглин В.Л., Черниговская Т.В. Решение силлогизмов в условиях преходящего угнетения правого или левого полушарий мозга // Физиол. человека.- 1990.- Т. 16, №5.- С.21-28. 3. Зальцман А.Г. Особенности переработки зрительной информации в правом и левом полушариях головного мозга человека // Физиология человека,- 1990.- Т. 16, №2,- С. 135-148. 4. Богданов Н.Н. Дерматоглифика пишущих левой // Вопр. психол.-1997.-№2.-С. 76-87. 5. Вассерман Л.И., Дорофеева С.А., Меерсон Я. А. Методы нейропсихологической диагностики.- СПб., 1997.- 304 с.6. Gardner H. What we know (and don’t know) about the two halves of the brain // Harvard Magazine.- 1978.- N. 80.- P. 24-27. 7. Prince G. Putting the other half of the brain to work // Magazine of human Resources Development.- 1978,- Vol. 15.- P. 57-61 8. Grabowska A., Herman A., Nowicka A. , Szatkowska I., Szelag E. Individual differences in the functional asymmetry of the human brain // Acta Neurobiol. Exp. Warsz.- 1994,- Vol. 54, N. 2.- P. 155-162.

    /12/ Проблема межполушарной асимметрии мозга и межполушарного взаимодействия // Студопедия.

    /13/ Krugman, Martin. Neuro-linguistic programming treatment for anxiety: Magic or myth? // Journal of Consulting and Clinical Psychology. 53(4), Aug 1985, 526—530.

    /14/ Dixon, PN; Parr GD; Yarbrough D; and Rathael M. (1986). Neurolinguistic Programming as a Persuasive Communication Technique. The Journal of Social Psychology, 126(4), 545—550.

    /15/ Fromme DK & Daniel J (1984). Neurolinguistic Programming Examined. Journal of Counseling Psychology 31 (3) 387—390.

    /16/ Neuro Hypnotic Repatterning; англ.: копирование нейрогипнотических паттернов.

    /17/ Design Human Engineering; англ.: дизайн человеческих ресурсов.

    /18/ См. подробнее: Существует ли в сектах «промывание мозгов»?

    /19/ (Human Potential Movements). Hunt, Stephen J. (2003). Alternative Religions: A Sociological Introduction . Hampshire: Ashgate Publishing Ltd; Barrett, David V. (1998). Sects, Cults and Alternative Religions: A World Survey and Sourcebook . Singapore: Blandford Press; Whiworth, Belinda (2003). New Age Encyclopedia: A Mind, Body, Spirit Reference Guide (1st ed.). New Jersey: New Page Books; Kemp, Daren; Lewis, James R., eds. (2007). Handbook of New Age (1st ed.). Leiden: Brill; Aupers, Stef; Houtman, Dick, eds. (2010). Religions of Modernity: Relocating the Sacred to the Self and the Digital (1st ed.). Leiden: Brill. pp. 115–132; Hammer, Olav; Rothstein, Mikael, eds. (2012). The Cambridge Companion to New Religious Movements (1st ed.). Cambridge: Cambridge University Press. p. 247; Cresswell, Jamie; Wilson, Bryan, eds. (1999). New Religious Movements: Challenge and Response (1st ed. ). London: Routledge. p. 64; Edwards, Linda (2001). A Brief Guide to Beliefs: Ideas, Theologies, Mysteries, and Movements (1st ed.). Kentucky: Westminster John Knox Press. p. 573; Walker, James K. (2007). The Concise Guide to Today’s Religions and Spirituality (1st ed.). Oregon: Harvest House Pubslishers. p. 235; Clarke, Peter B., ed. (2006). Encyclopedia of New Religious Movements (1st ed.). London: Routledge. pp. 440–1.

    /20/ Langford, Jean M. (February 1999). “Medical Mimesis: Healing Signs of a Cosmopolitan “Quack””. American Ethnologist. Wiley. 26 (1): 24–46.

    /21/ 1. Grinder, John; DeLozier, Judith (1987). Turtles All The Way Down: Prerequisites To Personal Genius (1st ed.). California: Grinder & Associates. 2. Grinder, John; Bostic St. Clair (2001). “Chapter 3: The New Code”. Whispering In The Wind. J & C Enterprises. p. 174.

    /22/ McClendon, Terrence L. (1989). The Wild Days. NLP 1972–1981 (1st ed. ). p. 41.

    /23/ Grimley, Bruce (2013). Theory and Practice of NLP Coaching: A Psychological Approach (1st ed.). London: Sage Publications Ltd. p.31.

    /24/ Jeremiah, David (1995). “Chapter 9 Corporate Takeovers”. Invasion of Other Gods: The Seduction of New Age Spirituality (1st ed.). W Publishing Group.

    /25/ Джон Гриндер и Кармен Бостик, «Шепот на ветру», 2001.

    /26/ Korzybski A. A Non-Aristotelian System and its Necessity for Rigour in Mathematics and Physics. Доклад в Американском математическом обществе (Новый Орлеан, штат Луизиана, США). Встреча American Association for the Advancement of Science. 28 декабря, 1931 года. Перепечатано в «Science and Sanity», 1933, стр. 747—761. (англ.)

    /27/ Лепехин Н.Н., Взгляд православного психолога на НЛП

    НЛП | психолог Оксана Королович

    Нейролингвистическое программирование (НЛП) – это модель описания поведения человека и коммуникативных навыков, которую используют не только как психотерапевтический метод, но и в бизнесе, педагогике, управлении персоналом компаний.
     
    НЛП – это результат исследований поведения 3-х психотерапевтов, работа с пациентами которых была крайне эффективна. Они умели устанавливать контакт и доверие, способствовать выздоровлению людей и при этом не делали никаких специфических действий. Это были: Фриц Перлз (методология гештальт терапии), Вирджиния Сатир (направление семейного консультирования) и Милтон Эриксон (одноименный гипноз).
     
    За психотерапевтами наблюдали в 1960-70 годах американцы Дж.Гриндер и Р.Бендлер. Они фиксировали каждую вербальную и невербальную мелочь специалистов во время проведения ими сеансов с пациентами, и пришли к выводу, что их модели взаимодействия поддаются анализу. Значит, этому можно научиться. НЛП основывается на убеждении, что любого человека можно научить эффективной коммуникации с другими.
     
    При этом метод основан на моделировании внешней эффективности социального поведения, а не на исследовании сути эмоциональной сферы.


    Опытному НЛПеру не нужно углубляться, выслушивать жалобы клиента и вникать в их смысл, подталкивая того к эмоциональному раскрытию.

     Достаточно узнать о наличии проблемы и специальными техниками помочь от нее избавиться.

    С одной стороны, НЛП этично в отношении личного пространства клиента и его чувств. Но с другой, такая поверхностность является основанием для критики метода как неэффективного, ненаучного и безосновательного. А теперь по порядку.

    На чем основано НЛП

    Нейролингвистическое программирование основано на:

    • Анализе вербального и невербального поведения психотерапевтов (Эриксон, Сатир и Перлз).
    • Понимании различий в работе мозговых межполушарий.
    • Возможностях изменения сообщений путем трансформации глубинных структур языка.
    • Отсутствии различий между искусственным и естественным интеллектом (кибернетика).

    В чем суть НЛП и основные понятия?
    1. Мозг человека подобен компьютеру, запрограммированному на определенные действия. Так, есть некая «программа», которая воспроизводит определенный опыт человека – его реакции на себя и окружающих, отношение к миру, формируя стереотипность и повторяемость в определенных условиях.
      Программы устанавливаются вследствие жизнедеятельности человека в состоянии транса. Это измененное состояние сознания, отличное от обычного. Оно «включается» помимо воли человека без использования каких-то технологий.
    2. Создание опыта и программ осуществляется путем усвоения различной информации на разных уровнях восприятия: визуальном (вижу), аудиальном (слышу), кинестетическом (ощущаю). Так формируется «картина мира» конкретной личности.
      Окружающий мир и социум посылает человеку информационные сигналы, которые записываются в мозге и предварительно обрабатываются ведущей системой восприятия. Например, есть люди, которым легче усваивать и запоминать услышанное, а есть те, кто не понимает, о чем речь, пока не потрогает. Кстати, визуалов и кинестетов в мире приблизительно равное количество, а вот настоящих аудиалов очень мало (порядка 5 – 7 %).
    3. Человек получает и обрабатывает информацию спонтанно и неосознанно. Таким образом, его программы покоятся в бессознательном, но проявляются в речевых формах и невербальном поведении. То есть, личность как-то проявляется, но почему она делает это именно так – не ответит. В задачу НЛПера входит «прочитать поведение» путем наблюдения и специальных вопросов в процессе работы. Ответы клиента подскажут, какие языковые структуры являются ведущими и как тот аккумулирует входящие данные, формируя свой опыт.
      Есть взаимосвязь между ведущей системой восприятия и речью человека. Аудиалы, например, используют в разговоре: «слышу», «звучит», «шумело». Визуалы: «смотрю», «видел», «отчетливо». Кинестеты: «ощущал», «мягкий», «пахнет».
    4. Поведение, даже дисфункциональное, является адаптацией к условиям жизни человека. Что бы тот не совершал – это нужно для выживания и комфорта. Стереотипность поведения зависит от успешности тех или иных действий – если поведение не привело к желаемому результату, оно не закрепляется.
      Успешное действие (напомню, речь не идет о моральном аспекте или оценке), наоборот, служит инструментом, который используется в подобных ситуациях. Если же человек сталкивается с невозможностью получить желаемое, хочет исправить пробелы в коммуникации или своем поведении, НЛП предлагает перепрограммирование стереотипного поведения.
      Это формирование новых реакций, которые выполняют ту же задачу – обеспечение выживаемости и комфорта жизни человека. Замечу, речь идет о внешних реакциях, а не об эмоциях. Психолог учит клиента выбирать стратегии поведения, но не сопроводительные эмоции.
    5. Процесс работы начинается с «подстройки» НЛПера под клиента с целью перепрограммирования. Это такое поведение психотерапевта, когда он повторяет действия клиента, манеры поведения и невербалику.
      Я бы охарактеризовала подстройку как «вроде ничего не спросили и в душу не заглянули, а чувство, что с человеком на одной волне». Психотерапевт распознает систему восприятия информации клиента, включается в нее и только тогда может работать к запросом клиента.

    Алгоритм НЛП

    Какая технология консультирования в нейролингвистическом программировании? Что вообще происходит в кабинете НЛПера?

    Любая техника НЛП реализуется по следующему алгоритму:

    1. Раппорт: это вышеописанная подстройка, когда клиент и НЛПер готовы работать.
    2. Обозначение запроса: проблема, с которой клиент обратился за помощью.
    3. Определение желаемого состояния: как клиент видит состояние после изменений. То есть, с какого на какое состояние меняем?
    4. Интеграция: изменение проблемы путем наложения, а затем, включения желаемого состояния, вследствие чего проблема исчезает.

    Предлагаю рассмотреть алгоритм на примере самой, наверное, известной техники в НЛП – «Взмах». Технику используют для изменения стремлений человека в любых сферах. Консультация психолога проходит такой алгоритм:

    • НЛПер дает клиенту время и возможность сосредоточиться на проблеме и представить ее максимально точно, в деталях (цвета, запахи, мелочи) путем выведения этой картинки на воображаемый «экран».
    • После чего клиенту предлагается представить так же детально картинку желаемого состояния.
    • Теперь НЛПер просит на первую (проблемную) наложить вторую (желаемую) в нижний правый угол «экрана».
    • Далее клиент делает «взмах», мгновенно расширяя вторую картинку до масштабов первой, стирая ее. Это можно делать с закрытыми глазами и сопровождать взмахом руки, например.
    • После «взмаха» следует сразу очистить «экран», открыв глаза, например. И проделать работу еще 4 раза (всего 5).
    • В случае «сработало» первое состояние (нежелательное) будет вызывать неприязнь или даже отвращение. Таким образом, мозг перепрограммируется на достижение желаемого состояния.

    Нейролингвистическое программирование широко известный коррекционный метод. Но его теоретическое обоснование и результативность техник вызывают массу споров в кругу академического сообщества. Напомню, один из основателей НЛП был лингвистом (Дж.Гриндер). Плюс некоторые «пресуппозиции» метода отвергнуты, как ложные, научными исследованиями в области медицины.

    Снижение холестерина: 17 советов как избежать заболеваний сердца

    Простые шаги для снижения холестерина
    Ваш доктор говорит что у вас высокий холестерин? Тогда вы знаете, что вам необходимо поменять свое питание и образ жизни, чтобы уменьшить холестерин и риск сердечных заболеваний. Даже если ваш врач пропишет лекарства для снижения уровня холестерина, все-равно необходимы изменения в питании и быть более активным для здоровья сердечно-сосудистой системы. Наши простые советы помогут держать уровень холестерина в порядке.
    Холестерин, плохой и хороший
    Наше тело нуждается в небольшом количестве холестерина для нормального функционирования. Но мы можем получать большое количество насыщенных жиров и холестерина  из еды. И то и другое увеличивает количество ЛНП (плохого) холестерина. ЛНП холестерин может вызывать образование бляшек в артериях, приводящих к сердечным заболеваниям. ЛВП (хороший) холестерин, с другой стороны, помогает очищать вашу кровь от плохого. Нам нужно снизить ЛНП холестерин и увеличить ЛВП холестерин, начнем с питания.
    Контроль количества пищи. Не более ладони за раз.
    Большинство людей употребляют в двое большее количество пищи за раз, чем это рекомендовано для здоровья. Это может привести к увеличению веса и высокому холестерину в крови. Вот легкий способ контролировать количество пищи: Используйте свою ладонь. Одна порция мяса или рыбы, это приблизительно столько, сколько помещается на вашей ладони. Одна порция свежих фруктов размером, примерно, с ваш кулак. И одна порция приготовленных овощей, риса, или макаронных изделий должна помещаться на обоих ладонях рук сложенных вместе.
    Больше полезной пищи
    Положите на свою тарелку больше фруктов и овощей, от пяти до девяти порций в день (см. предыдущий совет), чтобы снизить “плохой” ЛНП холестерин. Пользу окажут также антиоксиданты содержащиеся в этих продуктах. Употребляя больше фруктов и овощей, меньше остается “места” для жирной пищи. Также, это поможет снизить кровяное давление и поддерживать здоровый вес. Продукты обогащенные растительными стероидами, некоторые распространенные маргарины, йогурты и другие, также помогают снизить уровень “плохого” ЛНП холестерина.
    Для здоровья сердца полезны морские продукты
    Меню для здоровья сердца должно включать рыбу, как минимум, два раза в неделю. Почему? В рыбе содержится малое количество насыщенных жиров. И большое количество полезных омега-3 полиненасыщенных жирных кислот. Омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты помогают снижать уровень триглицеридов, определенный вид жиров в крови. Омега-3 также помогают снижать уровень холестерина, замедляют рост бляшек в артериях. Выбирайте жирную рыбу, такую как лосось, тунец, форель и сардины.
    Начните свой день с цельных зерен
    Миска овсянки или каша из цельного зерна послужат вам весь день. Клетчатка и комплекс углеводов в цельном зерне поможет чувствовать себя сытым дольше, т.е. у вас будет меньше искушения переесть в обед. Они также помогают уменьшить количество “плохого” ЛНП холестерина и могут быть важной частью вашей стратегии по снижению веса. Другие примеры цельных зерен включают в себя коричневый рис, попкорн, ячмень, хлеб из муки грубого помола.
    Орехи для здоровья сердечно-сосудистой системы
    Желаете перекусить? Горстка орехов будет вкусной альтернативой другим продуктам, которое способствует снижению количества холестерина в крови. Орехи содержат большое количество мононенасыщенных жиров, что снижает уровень “плохого” холестерина, оставляя “хороший” халестерин в норме. удаление зубного камня стоимость Несколько исследований показывают, что люди, которые съедают около 30 граммов орехов в день, имеют пониженный уровень риска сердечных заболеваний. Орехи содержат большое количество жира и калорий, поэтому старайтесь не съедать более 30 граммов орехов в день.
    Ненасыщенные жиры полезны для сердца
    Нам нужно немного жира в рационе — около 25 — 35 процентов из употребляемых калорий в день. Но вот тип жира имеет ключевое значение. Ненасыщенные жиры — содержащиеся в рапсовом, оливковом и подсолнечном маслах, помогают снизить уровень “плохого” холестерина и увеличить уровень “хорошего” холестерина. Насыщенные жиры, содержащиеся в пальмовом масле, и транс-жиры, содержащиеся в продуктах животноводства, повышают уровень “плохого” холестерина. Даже хорошие жиры содержат много калорий, поэтому не стоит злоупотреблять ими.
    Больше бобов, меньше картофеля
    Для нашего тела необходимы углеводы, но некоторые более полезны для организма чем другие. Цельные зерна, такие как коричневый рис, макаронные изделия из цельных зерен и бобовые содержат большее количество клетчатки и меньше поднимают уровень сахара в крови. Они помогают снизить холестерин и чувствовать себя сытым более длительное время. Другие углеводы, содержащиеся в белом хлебе, картофеле, белом рисе и пирожных, повышают уровень сахара намного быстрее. Это приводит к более быстрому чувству голода, и может увеличить риск переедания.
    Двигайтесь
    Даже 30 минут физической активности в день (для энергичных занятий, таких как бег, достаточно 20 минут три раза в неделю), поможет снизить уровень “плохого” и увеличить уровень “хорошего” холестерина. Чем больше упражнений, тем лучше. Физическая активность также помогает поддерживать здоровый вес, снижая вероятность развития закупорки артерий. Нет необходимости заниматься 30 минут подряд в день, можно разделить на занятия по 10 минут в течение дня.
    Прогулка
    Если вы не привыкли заниматься физическими упражнениями, и не любите посещать тренажерный зал — просто сходите на прогулку. Это легко, полезно, и все что нужно, это хорошая пара обуви. Такие занятия как ходьба, снижают риск инсульта и заболеваний сердца, помогают похудеть и укрепить кости. Если вы решили заниматься прогулками, начните с 10 минут в день, постепенно увеличивая длительность.
    Поработать без похода в спортзал
    Вы можете укрепить здоровье вашего сердца без упражнений или занятий в спортзале. Подходит любая активная деятельность, такая как садоводство, танцы или подъем по ступенькам вместо лифта. Даже работа по дому может классифицироваться как упражнение, если вы затеяли серьезную уборку, которая заставляет ваше сердце биться чаще.
    Ответственно относитесь к своему здоровью
    Если у вас высокий уровень холестерина, вы и ваш доктор можете использовать несколько стратегий для снижения этого уровня. Вы можете улучшать свою диету, снизить вес, заниматься физическими упражнениями, и даже принимать таблетки. Есть также другие советы, которые вы можете взять себе на вооружение, чтобы быть уверенным что находитесь на правильном пути.
    Что делать, если приходиться питаться не дома
    Довольно легко держать уровень холестерина под контролем, если вы готовите дома. Но как быть если приходиться питаться вне дома? Ресторанная пища может быть наполнена насыщенными жирами, калориями и натрием. Даже здоровую пищу могут принести в большой порции. Воспользуйтесь этими советами:
    Выбирайте продукты запеченные, приготовленные на пару или гриле, но не жаренные на масле.
    Если знаете что порция большая, заказывайте пол порции, вместо целой.
    Ищите скрытые ловушки
    Внимательное изучение этикеток приобретаемых продуктов имеет важное значение для диеты направленной на здоровье сердечно-сосудистой системы. Вот несколько советов:
    Если на упаковке написано “цельные зерна”. Прочтите этикетку, она должна содержать пшеницу из цельно зерна или муку из цельно зерна.
    Продукты, на которых указано, что они не содержат холестерин, все-равно могут повышать его уровень. Насыщенные жиры могут быть виновником этого повышения.
    Избегайте стресса
    Хронический стресс может повышать кровяное давление. Повышенное давление добавляет риск атеросклероза, когда бляшки с холестерина накапливаются на артериях. Исследователи также доказали, что для некоторых людей, стресс напрямую увеличивает уровень холестерина в крови. Снимайте стресс расслабляющими упражнениями или медитацией. Сосредоточьтесь на своем дыхании и сделайте глубокие вдохи. Эти простые действия можно делать в любом месте.
    Когда потеря означает победу
    Снижение веса — это лучшее что вы можете сделать для борьбы с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Ожирение увеличивает риск высокого холестерина, высокого кровяного давления, и диабета 2-го типа. Это все влияет на стенки ваших артерий, делая их более склонным к накоплению бляшек с холестерина. Снижение веса, особенно брюшного жира, который приводит к отвердеванию стенок артерий, помогает повышать “хороший” холестерин и снижать уровень “плохого”.
    Следуйте советам своего врача
    Управление уровнем холестерина — это пожизненный процесс. A2news.ru советует регулярно посещать врача, чтобы следить за своим здоровьем. Соблюдайте рекомендации врача по режиму питания, физических упражнений и лекарств. Работая вместе, вы и ваш доктор сможете снизить уровень холестерина и сохранить ваше сердце здоровым.

    Видео наглядно объясняющее вред холестерина:

    http://www.a2news.ru/

    Сдать анализ крови на холестерин ЛПНП

    Метод определения Расчет по формуле Фридвальда с использованием значений общего холестерина, холестерина ЛПВП и триглицеридов. При уровне триглицеридов более 4,5 ммоль/л – измерение прямым методом (колориметрия с использованием холестеролоксидазы и холестеролэстеразы).

    Исследуемый материал Сыворотка крови

    Доступен выезд на дом

    Онлайн-регистрация

    Синонимы: ЛПНП; Липопротеины низкой плотности; ЛНП; ХС ЛПНП; Холестерин липопротеинов низкой плотности; Холестерол бета-липопротеидов; Бета-липопротеины; Бета-ЛП. 

    LDL; LDL-C; Low-density lipoprotein cholesterol; Low density lipoprotein. 

    Краткая характеристика определяемого вещества 

    Холестерин-ЛПНП Липопротеины в крови осуществляют транспорт липидов различных классов, включая холестерин, от одной клеточной популяции к другой. Липопротеины низкой плотности (ЛПНП) являются основной транспортной формой холестерина, перенося его главным образом в виде эфиров холестерина. Относятся к бета-липопротеинам. Доказано, что содержание холестерина ЛПНП больше коррелирует с риском атеросклероза, чем уровень общего холестерина, поскольку именно эта фракция обеспечивает перенос как поступающего с пищей, так и синтезируемого холестерина, к клеткам органов и тканей. При патологии богатые холестерином ЛПНП аккумулируются на внутренних стенках артерий в местах образования атеросклеротических бляшек, которые сужают просвет сосудов и способствуют тромбообразованию. Поэтому исследование холестерина ЛПНП важно, как для оценки риска развития атеросклероза и его осложнений (инфаркт, инсульт), так и для контроля эффективности гиполипидемической терапии. 

    Обычно при скрининговой оценке факторов сердечно-сосудистого риска используют стандартный липидный профиль, который включает исследование общего холестерина, холестерина липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), триглицеридов и холестерина ЛПНП расчетным методом с помощью формулы Фридвальда. Такой расчетный метод оценки холестерина ЛПНП был использован в эпидемиологических и клинических исследованиях, на основании которых были установлены основные клинические рекомендации по желательному уровню холестерина ЛПНП для практически здоровых людей и его целевым терапевтическим значениям для лиц с высоким риском развития осложнений атеросклероза. Расчетный метод оценки холестерина ЛПНП остается наиболее распространенным. 

    Оценка холестерина ЛПНП расчетным методом имеет некоторые ограничения. Формула Фридвальда предполагает в качестве допущения постоянное соотношение триглицеридов и холестерина в липопротеинах очень низкой плотности и отсутствие избытка ремнантных (остаточных) липопротеинов. При гипертриглицеридемии и хиломикронемии эти допущения нарушаются, применение формулы Фридвальда при высоком уровне триглицеридов приводит к занижению расчетного результата холестерина ЛПНП. 

    С какой целью определяют уровень холестерина ЛПНП в крови 

    Определение холестерина ЛПНП в сыворотке крови используют в комплексе с другими тестами липидного профиля для оценки кардиорисков (отражает содержание «плохого холестерина»). Повышение уровня ассоциировано с бóльшим риском атеросклероза. При концентрации триглицеридов более 4,5 ммоль/л и низком значении холестерина ЛПНП (менее 1,3 ммоль/л) для оценки кардиориска и эффективности липидоснижающей терапии предпочтение следует отдавать холестерину не-ЛПВП.

    Внимание! Данное исследование отдельно не выполняется, только в комплексе с тестами № 30 Триглицериды, № 31 Холестерол общий, № 32 Холестерол ЛПВП. Более подробно с лабораторной оценкой параметров липидного обмена можно ознакомиться здесь.

    Что такое LNP?

    Переносимость местного номера

    (LNP), также известная как переносимость номера и перенос номера, позволяет конечным пользователям сохранять свой телефонный номер при переключении с одного поставщика телекоммуникационных услуг на другого. До введения LNP смена поставщика услуг означала необходимость получить новый номер телефона. Перенос номеров изменил ситуацию, позволив потребителям сохранить тот же номер телефона.

    История переносимости местных номеров (LNP)

    Переносимость местных номеров — это относительно новый процесс, который был предписан в США Законом о телекоммуникациях 1996 г. рынок услуг местной телефонной связи после дерегулирования телефонной отрасли в 1984 году. Однако ряд событий между 1984 и 1996 годами привели к разработке и внедрению LNP в США.S.

    До 1984 года одна телефонная компания, AT&T, владела и управляла распределением всех телефонных номеров другим телефонным компаниям. Телефонный номер представлял собой физический адрес коммутатора исходящего и / или конечного местного офиса (код города, телефонная станция и номер линии).

    Развитие телефонного номера

    Введен Телефонный номер Как подключено
    1890-е годы Бикон Хилл ХХХХ Оператор подключен
    1910-е годы BEH-XXXX 3 буквы, 4 цифры
    1930-е годы EH5-XXXX 2 буквы, 5 цифр
    1950-е годы 684-XXXX Набор всех номеров
    1960-е годы (703) 684-XXXX Набор из 10 цифр
    1995 г. (571) 684-XXXX Североамериканский план нумерации

    1984–1996

    В 1984 году отделение AT&T привело к образованию семи независимых региональных операционных компаний Bell (RBOC): AmeriTech, Bell Atlantic, BellSouth, NYNEX, Pacific Telesis, Southwestern Bell и US West.Семь RBOC контролировали распределение всех телефонных номеров на своих территориях. Началась конкуренция за услуги междугородной связи, в результате чего возникла необходимость сопоставить телефонный номер с поставщиком услуг междугородной связи.

    1996 — Закон о телекоммуникациях от 1996 года

    Закон о телекоммуникациях 1996 года был принят для стимулирования конкуренции в отрасли связи и стал первым капитальным пересмотром закона, регулирующего телекоммуникации в США с 1934 года. Ключевые положения:

    • Переносимость местного номера , позволяющая конечным пользователям менять поставщиков услуг и сохранять свои телефонные номера.
    • Вытеснение , разрешенное FCC для упреждения государственных или местных законодательных требований, которые выступали в качестве барьеров для входа в предоставление услуг межгосударственной или внутригосударственной электросвязи.
    • Взаимосвязанность , обязывающая традиционных операторов связи и новых участников подключать свои сети и устанавливающая условия и тарифы, которые не подрывали бы конкуренцию .
    • Компенсация между операторами связи , необходимая для начисления и выставления счетов за вызовы, которые происходят в разных сетях.В США оператор вызывающей стороны традиционно платит оператору вызываемой стороны за выполнение вызова.
    • RBOC могут входить в сеть для дальней связи, чтобы стимулировать конкуренцию на рынках дальней связи и на местных рынках.
    • Оптовый доступ к сети традиционных операторов предоставил новым участникам доступ по оптовым ценам, основанным на затратах, и время для создания собственных сетей.
    • Универсальная сервисная поддержка четко обозначена , чтобы гарантировать наличие правил и положений, обеспечивающих доступность телефонных услуг на всей территории U.С.

    После 1996 года

    Проще говоря, в 1996 году управление телефонными номерами стало сложным. Вместо семи региональных RBOC, контролирующих и управляющих номерами в своих регионах, телефонные номера теперь можно было перемещать между поставщиками услуг. Количество поставщиков услуг увеличивалось и уменьшалось с каждым годом по мере внедрения или расширения новых коммуникационных технологий и услуг. Новые технологии, такие как VoIP и доставка мультимедиа по IP, сейчас находятся на переднем крае и в некотором смысле затмили старую телефонную связь с коммутацией каналов.

    Операторам необходимо работать вместе, чтобы установить потоки обработки, системные требования и спецификации для проектирования, создания и администрирования обмена данными оператора связи — системы, которая является Центром администрирования переносимости номеров, NPAC.

    Преимущества переносимости местного номера

    Для потребителей Для поставщиков услуг связи
    Позволяет потребителю сохранить тот же номер телефона при переходе к другому поставщику услуг. Поощряет технологические инновации.
    Повышает готовность потребителя перейти к другому поставщику услуг, увеличивая конкуренцию. Стимулирует спрос на телекоммуникационные услуги.
    Усиление конкуренции дает потребителю больше возможностей выбора и снижает цены. ускоряет экономический рост в США.

    Объединение

    В 1999 году отрасль столкнулась с кризисом из-за исчерпания кодов центрального офиса (NPA-NXX).В 1947 году только 78 кодов городов были присвоены операторам связи в США. Только 36 новых кодов городов были добавлены в течение 1989 года. Но распространение новых поставщиков услуг (CLEC, операторы беспроводной связи и т. Д.) Быстро увеличило потребность в кодах центрального офиса. К концу 1990-х годов в США было активировано 109 новых кодов городов, чтобы удовлетворить спрос на коды центральных офисов. Отрасль столкнулась с проблемой исчерпания пула NPA и перехода к системе, которая требовала более 10 цифр для каждого телефонного номера, чтобы увеличить количество этих кодов.

    FCC выпустила отчет об использовании ресурсов нумерации в США, в котором рекомендовалось «объединение тысяч блоков номеров». Исторически все 10 000 телефонных номеров, связанных с кодом центрального офиса, были назначены одному поставщику услуг. Многие провайдеры были слишком маленькими, чтобы использовать все 10 000 номеров, в то время как более крупным провайдерам требовались дополнительные номера. Было введено объединение, чтобы позволить 10 000 номеров, связанных с кодом центрального офиса, быть разбитыми на десять последовательных блоков по 1000 номеров в каждом, что позволило назначить только один код центрального офиса для обслуживания нескольких операторов, обслуживающих одну и ту же тарифную зону.Поставщики услуг теперь должны сообщать об использовании своих номеров и передавать неиспользуемые или недостаточно используемые блоки телефонных номеров администратору национального пула, чтобы резервные блоки можно было назначить другим операторам связи, нуждающимся в номерах.

    Особенности LNP
    • 1996: вступил в силу Закон о телекоммуникациях, открывший местные рынки для конкуренции
    • 1996: Первый отчет и приказ Федеральной комиссии связи США, документ 95-116 предоставил нормативно-правовую базу для реализации LNP.
    • 1997: метод LRN принят FCC в качестве промышленного стандарта де-факто
    • 1997: Запрос предложений выпущен для системы управления услугами NPAC для поддержки внедрения переносимости номеров в одном из Чикаго, Иллинойс, LATA
    • 1997: Seven U.Базы данных S. созданы совпадающие с семью исходными регионами Bell Operating Company; первый номер перенесен в Мэриленд
    • 1997: Neustar (тогда СНГ, операционное подразделение Lockheed Martin) становится единственным поставщиком услуг NPAC для всех семи LLC и канадского консорциума LNP.
    • 1998: Канадский NPAC создан
    • 1998: LNP внедрен в 100 крупнейших MSA к концу 1998 г .; за пределами 100 лучших MSA, поставщик услуг должен внедрить LNP после получения добросовестного запроса на это
    • 2003: Реализована переносимость беспроводного номера

    Как работает LNP

    Перенос местного номера (LNP ) становится технически осуществимым с помощью номера маршрутизации местоположения (LRN), уникального 10-значного телефонного номера, присваиваемого каждому коммутатору.Подход LRN позволил внедрить LNP без радикального изменения коммутируемой телефонной сети общего пользования. Это позволило сохранить существующую парадигму маршрутизации, позволив постепенное преобразование сети для обработки трафика LNP.

    До создания LNP NPA-NXX телефонного номера определяла состояние и тарифный центр, где номер был первоначально назначен, поставщика услуг и тип оператора (проводной или беспроводной). Сегодня, поскольку телефонные номера были перенесены между поставщиками услуг проводной и беспроводной связи, NPA-NXX телефонного номера идентифицирует только штат и тарифный центр, где номер был первоначально назначенный.NPA-NXX LRN теперь служит сетевым адресом, который помогает поставщикам услуг связи экономически эффективно направлять вызовы и трафик по назначению.

    Вызовы маршрутизируются на основе первых шести цифр (NPA-NXX) телефонного номера. NPA-NXX — это адрес коммутатора, обслуживающего телефонный номер. Когда номер переносится, 10-значный LRN связывается с перенесенным номером. Вместо этого вызовы на перенесенный номер маршрутизируются на основе NPA-NXX 10-значного LRN.

    До создания LNP NPA-NXX телефонного номера идентифицировал коммутатор, обслуживающий номер, состояние и тарифный центр, где номер был первоначально назначен, а также поставщика услуг. Поскольку LNP позволяет переносить номер с одного коммутатора на другой, NPA-NXX телефонного номера больше не является надежным индикатором обслуживающего коммутатора и идентичности поставщика услуг. Сегодня, поскольку номера были перенесены между поставщиками услуг проводной и беспроводной связи, на NPA-NXX телефонного номера больше нельзя полагаться, чтобы определить, обслуживается ли номер поставщиком услуг проводной или беспроводной связи.

    Префикс
    Расшифровка телефонного номера
    NPA Номер зоны плана (код города)
    NXX (код центрального офиса)
    XXXX Номер строки
    • N может быть любым числом от 2 до 9
    • P, A, может быть любым числом от 0 до 9
    • X может быть любым числом от 0 до 9

    Например: (571) 434-5400:

    • 571 — это код города, присвоенный в Вирджинии
    • 571-434 — это биржа, назначенная Verizon Virginia, Inc.связаны с тарифным центром Herndon и обслуживаются от коммутатора HRDNVASTDS0.
    • 5400 — это номер линии, присвоенный АТС Neustar

    LNP использует метод номера маршрутизации местоположения

    Номер маршрутизации местоположения (LRN) — это десятизначное число, которое выглядит как номер телефона. LRN назначается каждому перенесенному телефонному номеру и используется для маршрутизации вызовов через PSTN к коммутатору, обслуживающему перенесенный номер. Однако LRN предназначен только как сетевой адрес обслуживающего коммутатора и не предназначен для передачи какой-либо информации о зоне скорости, которая может использоваться для определения того, является ли вызов локальным или междугородным.Один и тот же десятизначный LRN может использоваться для каждого перенесенного номера, обслуживаемого коммутатором, которому назначен NPA-NXX LRN. LRN — это не телефонный номер. Одна и та же десятизначная строка может использоваться как для LRN, так и для индивидуального телефонного номера, назначенного коммутатору LRN. Однако лучше всего избегать использования одной и той же десятизначной строки как для номера телефона потребителя, так и для LRN.

    Перенос номера на другого оператора

    Существует два сценария того, почему телефонные номера переносятся в Канаде: перенос между операторами связи / конкурентный перенос, перенос внутри оператора связи.

    Тип подключения Что есть Влияние на телефонные номера
    Межоператорская или конкурентная Перемещает номер от оператора связи, который в настоящее время предоставляет услугу, к поставщику услуг, который будет предоставлять услугу. Изменяет коммутатор, на котором находится номер, и оператора, предоставляющего услугу конечному пользователю.
    Внутринесущая Добавляет запись в NPAC; может также переместить номер с одного коммутатора на другой в сети того же оператора. Используется, когда оператор связи, владеющий номером, помещает его в NPAC по причинам, отличным от конкурентного переноса. Нет никаких изменений в носителе.

    Этапы процесса переноса LNP

    Чтобы понять этапы процесса переноса, может быть полезно объяснить этапы процесса. Ниже приведено общее описание этапов обработки и процесса переноса для типичного конкурентного порта. В этом случае потребитель переключается на нового поставщика услуг связи и хочет сохранить свой существующий номер телефона.

    1. Новый поставщик услуг уведомляет старого поставщика услуг о запрошенном порту.
    2. У старого поставщика услуг запрашивается подтверждение информации о подписчике.
    3. Старый поставщик услуг подтверждает информацию об абоненте и уведомляет нового поставщика услуг.
    4. Новый поставщик услуг уведомляет NPAC о запрошенном порте.
    5. NPAC создает ожидающий порт и отправляет уведомление старому поставщику услуг.
    6. Необязательно, старый поставщик услуг уведомляет NPAC о том, что он согласен с портом.
    7. Новый поставщик услуг уведомляет NPAC об активации порта.
    8. Ожидающий порт активируется в NPAC и транслируется в сеть телекоммуникационной отрасли в течение миллисекунд.

    Каждая запись NPAC, называемая версией подписки, содержит различную информацию о номере телефона, включая:

    • Телефонный номер
    • Текущий присвоенный идентификатор поставщика услуг (SPID)
    • Тип поставщика услуг (например, беспроводной или проводной)
    • LRN
    • Коды точек назначения
    • SS7 (LIDB, CNAM, CLASS и т. Д.)
    • Тип услуги (например, VoIP класса 2 или беспроводная связь по предоплате)
    • Альтернативный SPID (для идентификации торгового посредника)
    • Биллинг ID
    • Местоположение конечного пользователя и тип

    Для операторов связи, использующих автоматизированные решения для обработки и при отсутствии ошибок или проблем с проверками и уведомлениями, процесс переноса обычно завершается в течение нескольких минут. Даже провайдеры, использующие ручные процессы, если нет ошибок или проблем с проверками и это простой порт, FCC требует, чтобы запрос был выполнен в течение одного рабочего дня.

    Поток вызовов на перенесенный телефонный номер

    Когда выполняется вызов на перенесенный телефонный номер, коммутатор инициирующего поставщика услуг запускает запрос к своей базе данных маршрутизации вызовов LNP, чтобы определить, был ли перенесен телефонный номер. Если да, то ответ базы данных предоставляет коммутатору LRN, необходимый для правильной маршрутизации вызова. Если номер не перенесен, ответ базы данных указывает, что вызов должен быть маршрутизирован на основе телефонного номера. Когда в пути вызова задействовано несколько коммутаторов, предпоследний оператор связи несет ответственность за выполнение запроса к базе данных LNP, если он еще не был выполнен.

    Связь между эндосомным ускользанием LNP-мРНК и загрузкой в ​​EV для транспортировки в другие клетки

    Составление и характеристика LNP

    DLin-MC3-DMA и DLin-DMA LNP, содержащие модифицированную hEPO-мРНК (858 нуклеотидов) (5meC, Ψ ) (Trilink) получали осаждением мРНК четырьмя различными липидными компонентами, как описано ранее 64 . Эти компоненты состоят из ионизируемого липида; DLin-MC3-DMA или DLin-DMA, которые являются ионизируемыми (катионными) при низком pH, два вспомогательных липида (DSPC и холестерин) и пегилированный липид (DMPE-PEG2000).Раствор hEPO-мРНК в воде получали смешиванием мРНК, растворенной в MilliQ-воде, 100 мМ цитратном буфере, pH = 3, и MilliQ-воде с получением раствора 50 мМ цитрата. Липидные растворы в этаноле (99,5%) были приготовлены с композицией из четырех липидных компонентов [ионизируемый липид: холестерин: DSPC: DMPE-PEG2000] = 50: 38,5: 10: 1,5 мол.% И общее содержание липидов 12,5 мМ. Растворы мРНК и липидов смешивали в микрофлюидной системе смешивания NanoAssemblr (Precision Nanosystems) при объемном соотношении смеси Aq: EtOH = 3: 1 и постоянной общей скорости потока 12 мл / мин.Во время смешивания соотношение между атомами азота ионизируемого липида и атомами фосфора в цепи мРНК составляло 3: 1. Если были приготовлены «пустые» LNP, то есть LNP без какой-либо мРНК, фаза этанола смешивалась только с 50 мМ цитратным буфером pH = 3. Первоначальные 0,35 мл и последние 0,05 мл приготовленного раствора LNP были выброшены, а остальная часть Объем собирали как фракцию образца.

    В некоторых препаратах LNPs, Cy5-EGFP-мРНК (996 нуклеотидов) (5meC,) (Trilink) загружали вместо мРНК hEPO для отдельных экспериментов.

    Для характеристики сформулированных LNP после приготовления 25 мкл фракции образца вводили в 975 мкл 10 мМ фосфатного буфера (pH 7,4) и использовали для измерения среднего по интенсивности размера частиц (Z-среднее) на ZetaSizer (Malvern Instruments Inc.). Фракцию образца немедленно переносили в диализную кассету Slide-a-lyzer G2 (10000 MWCO, Thermo Fischer Scientific Inc.) и диализовали в течение ночи при 4 ° C против PBS (pH 7,4). Объем буфера PBS был в 650-800 раз больше объема фракции образца.Фракцию образца собирали и из этого объема вводили 25 мкл в 975 мкл 10 мМ фосфатного буфера (pH 7,4) и снова измеряли размер частиц (размер частиц после диализа). Конечную концентрацию мРНК и эффективность инкапсуляции (EE) измеряли с помощью набора Quant-it Ribogreen Assay Kit (Thermo Fischer Scientific).

    Клеточная культура

    Линия эпителиальных клеток человека HTB-177 (NCI-h560), приобретенная в АТСС, культивировалась в соответствии с руководящими принципами АТСС. Среда для выращивания RPMI-1640 (Sigma Aldrich), содержащая бикарбонат натрия, без пирувата натрия и HEPES, была дополнена 10% обедненной экзосомами фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Sigma), 1% l-глутамином (Thermo Fisher Scientific) и 1% пенициллин-стрептомицин (Thermo Fisher Scientific) при 37 ° C в присутствии 5% CO 2 .Инактивированный нагреванием FBS истощали экзосомами путем ультрацентрифугирования при 120000 × g в течение 2 часов при 4 ° C на ультрацентрифуге Optima L-100 XP с ротором 70 Ti (Beckman Coulter) и надосадочную жидкость, лишенную экзосом, фильтровали через фильтры 0,2 мкм. Свежие лейкоциты от здоровых доноров получали из больницы Sahlgrenska University (Гетеборг, Швеция), а мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) выделяли центрифугированием в градиенте плотности. PBMC культивировали в полной ростовой среде RPMI-1640 с добавлением L-глутамина, заменимых аминокислот, пирувата натрия, 1% пенициллин-стрептомицина, β-меркаптоэтанола, 10% обедненного экзосомами FBS и стимулировали козьим антителом против человеческого IgA / Фрагменты IgG / IgM F (ab ‘) 2 2.5 мкг / мл (Jackson ImmunoResearch Laboratories) и ацетат форбола миристата (PMA) 1 мкг / мл (InvivoGen).

    Доставка мРНК hEPO

    в эпителиальные клетки через LNP

    Клетки HTB-177 высевали с плотностью 3 × 10 6 клеток / 175 см 2 колбы в 30 мл ростовой среды. После инкубации (адаптации) в течение 24 часов клетки обрабатывали 1 мл DD- или MC3-LNP, содержащего 100 мкг мРНК hEPO / флакон в присутствии 1% сыворотки крови человека (Sigma Aldrich), которые вводили тремя разными способами. дозы; День (1) 200 мкл LNP (20 мкг мРНК), день (2) 400 мкл LNP (40 мкг мРНК), день (3) 400 мкл LNP (40 мкг мРНК) и собирают через 96 часов.Клетки, обработанные равным объемом (200 мкл, 400 мкл, 400 мкл) соответствующих LNP с пустым DD или пустым MC3 (без мРНК), а также необработанные клетки использовали в качестве отрицательного контроля.

    Обнаружение и количественная оценка мРНК hEPO в эпителиальных клетках

    Общую РНК из клеток HTB-177 выделяли с использованием набора для выделения РНК miRCURY TM — Cell and Plant (Exiqon) в соответствии с инструкциями производителя. Суммарную РНК количественно определяли с помощью флуорометра Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific), а качество РНК (соотношение 230/260) оценивали с помощью NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific).Исходя из выхода РНК, от 0,25 до 1 мкг общей клеточной РНК было преобразовано в кДНК с использованием набора кДНК высокой емкости (Thermo Fisher Scientific). 100 нг кДНК использовали для количественного определения мРНК hEPO с использованием анализа зонда TaqMan (Applied Biosystems; идентификатор анализа Hs01071097_m1) на приборе ViiA ™ 7 (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Для построения стандартной кривой 2 мкг чистой мРНК hEPO подвергали обратной транскрипции и полученную кДНК серийно разводили (десятикратно) для получения семи стандартов (наивысшая точка: 100 нг), которые обрабатывали в трех технических повторностях.Клеточную кДНК использовали для анализа мРНК hEPO, абсолютное количественное определение которого было интерполировано по стандартной кривой с минимальным значением R 2 > 0,975. GAPDH (ID анализа Hs02758991_g1) использовали в качестве внутреннего контроля.

    Выделение внеклеточных везикул

    EV выделяли из кондиционированной культуральной среды клеток, обработанных LNP, и отрицательных контролей. Вкратце, для удаления клеточного дебриса культивированную среду центрифугировали при 3000 × g в течение 15 минут при 4 ° C на центрифуге 4K15 (Sigma), и полученный супернатант собирали и ультрацентрифугировали при 60000 × g в течение 35 минут при 4 ° C с последующей фильтрацией через 0 ° C.2 мкм фильтры для получения электромобилей диаметром менее 200 нм. Наконец, отфильтрованный супернатант ультрацентрифугировали с использованием ультрацентрифуги Optima L-100 XP с ротором 70 Ti (Beckman Coulter) при 120000 × g в течение 70 мин при 4 ° C для осаждения EV. Осадки EV ресуспендировали в 50–80 мкл PBS. EV, секретируемые после эндоцитоза LNP, были определены как эндо-EV.

    Характеристика EV по общей РНК и содержанию белка

    EV были определены количественно на основе их общей концентрации белка и общей РНК.2 мкл суспензии EV, инкубированные вместе с 2 мкл реагента для экстракции белка млекопитающих M-PER (Thermo Fisher Scientific), обрабатывали ультразвуком на ультразвуковом очистителе (VWR) в течение 5 минут при 54 ° C для получения экстрактов EV. Белки EV были количественно определены с помощью флуорометра Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя.

    Суммарную РНК из EV выделяли с использованием набора для выделения РНК miRCURY TM — Cell and Plant (Exiqon) в соответствии с инструкциями производителя. Общая РНК была определена количественно с помощью Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific) и качество РНК (соотношение 230/260) оценивали с помощью NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific).

    Характеристика EV по размеру и концентрации

    mc3-EV (т.е. эндо-EV, выделенные из клеток, обработанных MC3-LNP) и необработанные EV оценивались по их размеру (нм) и концентрации (частиц / мл) с помощью LM10 ( Malvern Panalytical), оборудованный камерой Hamamatsu C11440-50B / A11893-02. Перед анализом частицы разбавляли в 500 раз 0.1 мкМ отфильтрованный PBS (Sigma) для уменьшения количества частиц в поле зрения ниже 180 / кадр. Три независимых измерения (биологические повторы) были выполнены в режиме рассеяния. Измерения для каждой EV-выборки были сняты в пяти захватах по 60 с каждая при 25 кадрах в секунду (fps), при настроенном уровне камеры (10–16) и пороге обнаружения (5–15) в зависимости от индивидуального образца и ручного мониторинга. температуры. Размытие и максимальная дистанция прыжка были установлены на авто. Считывание, сбор данных и анализ данных были выполнены с использованием программного обеспечения NanoSight Fluorescent NTA LM10 версии 3.3 (Малверн Паналитикал).

    Обнаружение полученной из LNP экзогенной hEPO-мРНК в EV

    МРНК hEPO в эндо-EV после введения LNP и в соответствующих отрицательных контролях количественно определяли с помощью qPCR. Исходя из выхода РНК, от 0,25 до 1 мкг общей EV-РНК было преобразовано в кДНК с использованием набора кДНК высокой емкости (Thermo Fisher Scientific). Сотни нанограммов кДНК использовали для количественного определения мРНК hEPO с использованием анализа зонда TaqMan (Applied Biosystems; идентификатор анализа Hs01071097_m1) на приборе ViiA ™ 7 (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя.Для построения стандартной кривой 2 мкг чистой мРНК hEPO подвергали обратной транскрипции и полученную кДНК серийно разводили (десятикратно) для получения семи стандартов (наивысшая точка: 100 нг), которые обрабатывали в трех технических повторностях. КДНК EV использовали для анализа мРНК hEPO, абсолютное количественное определение которого было интерполировано по стандартной кривой с минимальным значением R 2 > 0,975. GAPDH (ID анализа Hs02758991_g1) использовали в качестве внутреннего контроля.

    Обнаружение маркеров EV и мРНК в CD63 / CD9-положительных EV

    Клетки HTB-177 обрабатывали MC3-LNP, содержащими 100 мкг мРНК Cy5 (Trilink), как описано выше.Необработанные клетки были включены в качестве контроля. Через 96 ч общие EV выделяли с помощью UC (предварительное обогащение) и количественно оценивали. После предварительного обогащения CD63 / CD9-положительные EV выделяли с использованием метода, основанного на аффинности, и оценивали на наличие мРНК Cy5 с помощью FACS. Во-первых, для иммобилизации EV CD63 + на магнитных бусинах в соответствии с инструкциями производителя использовали реагент для выделения / обнаружения экзосомы CD63 человека для среды для культивирования клеток (Thermo Fisher Scientific). В реакции связывания 20 мкл шариков инкубировали с 25 мкг или 50 мкг общих mc3-EV или общих необработанных EV.В качестве отрицательного контроля 20 мкл гранул инкубировали с эквивалентным объемом PBS (без EV). После иммобилизации EV CD63 + эти EV окрашивали мышиным антителом против PE-CD9 человека (BD Pharmingen ™, каталожный номер 555372), разведенным 1: 6 в соответствии с инструкциями производителя. EV были получены на системе BD FACSLyric (BD Biosciences), были обнаружены мРНК CD9 и Cy5, и данные были проанализированы с использованием программного обеспечения FlowJo (TreeStar Inc.). Эксперимент проводили в биологической дубликате.Стратегия стробирования для гранул с помощью анализа FACS представлена ​​на дополнительном рис. 11а.

    Анализ прямого переноса мРНК из LNP в EV

    EV, выделенные из необработанных клеток, инкубировали с MC3-LNP или DD-LNP, содержащими hEPO-мРНК (в PBS в отсутствие клеток) LNP и EV были непосредственно смешаны и инкубированы ( в отсутствие клеток) при 37 ° C с использованием различных пропорций LNP и EV. Две разные пропорции EV, не использованные в любом предыдущем лечении, инкубировали с 300 мкл DD-LNP или MC3-LNP (39 мкг мРНК hEPO) в течение 2 часов в 30 мл PBS при 37 ° C.В первой установке соотношение между EV и LNP составляло 200 мкг EV + 300 мкл LNP (39 мкг мРНК hEPO), тогда как во втором условии соотношение составляло 50 мкг EV + 300 мкл LNP (39 мкг мРНК hEPO). После 2 ч инкубации с LNP-hEPO-mRNA, EV были повторно выделены с помощью ультрацентрифугирования, общая РНК из EV была выделена, и присутствие мРНК hEPO было проанализировано с помощью qPCR, чтобы оценить, осуществляется ли прямой перенос мРНК hEPO из LNP в EV. произошло. В качестве отрицательного контроля эквивалентные объемы DD-LNP или MC3-LNP инкубировали в PBS без EV и ультрацентрифугировали.В качестве положительного контроля в клетки вводили mc3-LNP или DD-LNP, содержащие hEPO-мРНК, и выделяли EV (так называемые mc3-EV или dd-EV) и мРНК анализировали с помощью qPCR. Эксперимент проводили в трех биологических повторностях. Данные представлены в виде процента мРНК hEPO, обнаруженной в EV, относительно введенного количества hEPO-мРНК, доставленной LNP в клетки, или количества hEPO-мРНК, непосредственно смешанного с EV. Показаны средние значения со стандартным отклонением (SD) повторов.

    Анализ защиты EV-мРНК

    Клетки HTB-177 обрабатывали MC3-LNP, содержащими 100 мкг hEPO-мРНК, как описано выше.Необработанные клетки были включены в качестве контроля. Через 96 часов ЭВ были изолированы и количественно определены. Во-первых, чтобы оценить эффективность активности РНКазы A (Thermo Fisher Scientific), 280 нг чистой hEPO-мРНК (Trilink) инкубировали с РНКазой A (0,5 мкг / мкл) или с равным объемом PBS при 37 ° C. ° C в течение 20 мин. Затем 200 мкг mc3-EV обрабатывали РНКазой A в тех же условиях. В качестве отрицательного контроля 200 мкг mc3-EV и 150 мкг необработанных EV инкубировали в тех же условиях, за исключением того, что РНКазу A заменяли PBS.После инкубации общую РНК из EV выделяли с использованием набора для выделения РНК miRCURY TM Kit-Cell and Plant (Exiqon). HEPO-мРНК количественно определяли с помощью кПЦР для оценки влияния РНКазы A на содержание hEPO-мРНК, если она присутствует вне EV. Эксперименты проводили в трех биологических повторностях.

    Градиентный UPLC для анализа ионизируемых липидов в EV

    Фракцию EV использовали для исследования присутствия ионизируемых липидов, производных LNP, в EV. От пяти до десяти микролитров каждого образца EV i.е. mc3-EV и dd-EV (полученные из клеток, обработанных MC3 и DD-LNP, соответственно) разбавляли в 50 раз PBS и дополнительно разбавляли 1 + 1 смесью 2% мас. / об. Triton® X-100 в Буфер Трис / ЭДТА. Образцы инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут, а затем вводили в систему Acquity Ultra Performance LC, соединенную с детектором Single Quad, SQD (Waters, Milford). Аналитическая колонка представляла собой Waters Acquity UPLC® CSH C18, 1,7 мкм, 2,1 × 100 мм, выдерживаемая при 60 ° C. Скорость потока составляла 0,50 мл / мин при использовании подвижной фазы 0.1% муравьиной кислоты в воде (A) и 0,1% муравьиной кислоты в равной смеси ацетонитрила и изопропилового спирта (B). Был применен градиентный прогон, при котором 10% B через 0,0 мин увеличивалось до 85% B через 1,0–5,0 мин и поддерживалось на уровне 85% B до 7,5 мин. Стадия промывки 99% B при 7,6–9,5 мин была включена в градиентный прогон. Затем 10% B применяли для кондиционирования с 9,6 до 12,0 минут. Разделение между основным пиком Triton X-100 и катионными липидами было хорошим в этих условиях со временем удерживания Triton X-100, равным 5.1 мин, DLin-DMA 6,3 мин и DLin-MC3-DMA 6,5 мин. Количественный анализ проводили с использованием внешних стандартных растворов DLin-DMA и DLin-MC3-DMA, растворенных в этаноле 99,5%, по крайней мере для пяти различных концентраций, охватывающих ожидаемые концентрации образца с хорошей корреляцией каждой стандартной кривой. SQD запускали с использованием электрораспыления в позитивном режиме и настраивали с помощью автонастройки с раствором DLin-MC3-DMA. Регистрацию катионных липидов производили с использованием одноионной регистрации (SIR) при М + 1 для каждого катионного липида.

    Наконец, молярное отношение ионизируемого липида к нуклеотидам мРНК hEPO (ионизируемый липид: мРНК) определяли как в EV, так и в LNP. Эксперименты проводились по крайней мере в шести биологических повторностях как для mc3- и dd-EV, так и для их соответствующих LNP.

    Количественное определение белка hEPO

    После обработки LNP кондиционированный клетками супернатант собирали и сохраняли для обнаружения белка hEPO. Суммарные клеточные белки экстрагировали из клеточного лизата с использованием 500 мкл реагента для экстракции белков млекопитающих M-PER (Thermo Fisher Scientific) в присутствии 1% коктейля ингибиторов остановки протеазы (Thermo Fisher Scientific).Вкратце, клетки осторожно встряхивали на трехмерном био-качалке в течение 10 минут при 4 ° C и центрифугировали при 14000 × g в течение 10 минут для осаждения клеточного дебриса, а полученный супернатант (содержащий белки) переносили в новый трубка. Параллельно культивированный супернатант центрифугировали при 3000 × g в течение 15 минут при 4 ° C на центрифуге 4K15 (Sigma) для удаления клеточного дебриса и выделения EV. Для создания экстрактов белка EV 2 мкл суспензии EV инкубировали вместе с 2 мкл реагента для экстракции белка млекопитающих M-PER и обрабатывали ультразвуком на ультразвуковом очистителе (VWR) в течение 5 минут при 54 ° C.Общие белки из всех образцов (кондиционированный супернатант, клеточный лизат и EV лизат) количественно определяли с помощью флуорометра Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific). Для обнаружения белка hEPO использовали набор Erythropoietin ELISA Kit (STEMCELL Technologies, номер по каталогу 01630) в соответствии с инструкциями производителя. Было использовано пятьдесят микролитров общего раствора белков, и уровни белка hEPO были рассчитаны в соответствии с относительной стандартной кривой как мЕд / мл. Концентрация была преобразована в фг / мл с использованием преобразования (119mU = 1 нг) и нормализована к общему количеству клеток.

    Влияние LNP на рост клеток, РНК и содержание белка

    Чтобы определить влияние LNP на поведение клеток и их устойчивость к лечению LNP, оценивали время генерации клеток, общую клеточную РНК, общее количество внутриклеточных белков и секретируемых белков. рассчитано после периода обработки DD- или MC3-LNP 96 часов. Влияние LNP на EV также исследовали путем количественной оценки EV, общей EV-РНК и количества белка EV против лечения LNP.

    Время генерации клеток ((G), время (в часах) для удвоения популяции клеток) было рассчитано на основе разницы между количеством клеток в начале и в конце интервала обработки (delta #cells я.е. ΔN) по следующей формуле:

    $$ \ begin {array} {l} G = t / n \\ t = {\ mathrm {LNPs}} \, {\ mathrm {administrator}} \, {\ mathrm { interval}} \, \ left (h \ right) \\ n = {\ mathrm {log}} \, \ left ({n. \, {\ mathrm {cells}} \, {\ mathrm {post — администрирование}) }} \ right) — {\ mathrm {log}} \, \ left ({n. \, {\ mathrm {cells}} \, {\ mathrm {до администрирования}}} \ right) / {\ mathrm { log2}} \ end {array} $$

    Вариации общей РНК в клетках и в EV, а также общего белка в EV, общих белков в клетках и в супернатанте культивирования были нормализованы до соответствующего ΔN.

    Доставка мРНК hEPO

    в эпителиальные клетки человека через EV

    Клетки HTB-177 высевали с плотностью 5 × 10 6 клеток / 175 см колбу 2 и культивировали в полной среде RPMI-1640. Шестьсот микрограммов mc3-EV (700 нг мРНК hEPO), которые были выделены из клеток, обработанных MC3-LNP, и 600 мкг dd-EV (1100 нг мРНК hEPO), выделенных из клеток, обработанных DD-LNP, растворяли в RPMI-1640. среду и различные дозы этих ЭВ переносили в клетки-реципиенты в независимых экспериментах в течение 2 дней: день 1, 300 мкг, и день 2, 300 мкг (в двух разделенных на время дозах по 150 мкг каждая через 8 часов).Пустые EV (без мРНК hEPO) и EV из необработанных клеток доставляли в клетки-реципиенты в качестве контроля. Через 48 часов собирали клетки и культивированный супернатант; Была выделена общая РНК, и мРНК hEPO и белок hEPO были оценены с помощью количественной ПЦР и ELISA, соответственно. Эксперимент проводили в двух независимых биологических повторностях.

    Доставка мРНК цианина 5 в клетки через эндо-ЭВ

    Один мл DD-LNP, содержащих флуоресцентную мРНК Cy5, был доставлен в клетки HTB-177 в различных дозах (200, 400, 400 мкл), за исключением 1 мл LNP. содержал 76 мкг флуоресцентной мРНК Cy5 / флакон (что в случае мРНК hEPO составляло 100 мкг / мл).Через 96 часов после введения LNP кондиционированную среду (супернатант) собирали и использовали для выделения EV. Пустые DD-LNP и необработанные клетки использовали в качестве контроля. Клетки HTB-177 и иммунные клетки, такие как B-клетки, T-клетки и моноциты, очищенные от PBMC, высевали с плотностью 2 × 10 5 клеток / лунку и культивировали в 200 мкл среды для культивирования в 96-луночном круглом дне. планшеты и инкубировали в течение ночи при 37 ° C, 5% CO 2 . Через 24 часа стимуляции культивированных клеток 78 мкг dd-EV, содержащих мРНК Cy5, в 25 мкл раствора PBS были доставлены в клетки-реципиенты.В качестве контрольных анализов пустые dd-EV и EV из необработанных клеток доставляли в клетки или клетки, оставшиеся необработанными. После 5, 24 и 48 часов обработки EV клетки собирали и окрашивали для определения поверхности моноклональными антителами (mAb) BV421 против CD19 (B-клетки), CD3 (T-клетки) и CD14 (моноциты) (Becton-Dickinson Biosciences). ), которые были разбавлены 1:20. Клетки собирали на FACSVerse (BD Biosciences), мРНК Cy5 определяли на основе флуоресценции в каждом типе клеток, и данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar Inc.). Стратегия стробирования клеток с помощью анализа FACS представлена ​​на дополнительном рис. 11b, c.

    Влияние pH на высвобождение мРНК hEPO из LNP

    MC3-LNP, содержащие мРНК hEPO с концентрацией 0,011 мг / мл, инкубировали в 10 мМ лимонной кислоте -Na 2 HPO 4 буферных растворах с 150 мМ NaCl различных Среда с pH (pH 7,4, 6,6 и 5,8) при 37 ° C в спокойных условиях. Общее количество мРНК измеряли в нулевой момент времени, используя 0,125 мМ TritonX-100 (VWR Proteomics Grade) и 0.125 мМ додецилсульфат натрия (Sigma) в тесте RiboGreen, чтобы можно было рассчитать фракцию высвобожденной мРНК. Для оценки доли мРНК, высвобождаемой из LNPs при различных значениях pH, свободное количество мРНК анализировали с помощью набора для анализа реагентов Quant-iT RiboGreen RNA Reagent Assay (Thermo Fisher Scientific) с использованием люминесцентного спектрометра Perkin Elmer LS55 (например: 480 нм, em: 525 нм).

    Перенос мРНК hEPO in vivo через EV и MC3-LNP

    Экспериментальные процедуры были одобрены (номер этической заявки 83-2015) Региональным комитетом по этике лабораторных животных Гетеборга, Швеция.Все процедуры соответствуют шведскому Закону о благополучии животных и правилам SJVFS 2012: 26. Самки мышей C57BL6 / NCrl ( n = 36) в возрасте 9–10 недель были приобретены в лаборатории Charles River, Германия и размещены в помещении для животных. в Astra Zeneca, Mölndal, Швеция. Мышей содержали группами по четыре мышей в клетке в стандартных условиях (21 ° C RT, 12:12 ч цикл свет-темнота, влажность воздуха 45–55%) с доступом к нормальной диете (R70, лактамин AB) и воде. вволю. Обеспечено обогащение окружающей среды (картонные коробки, деревянные шпатели для языка и хлопковые подушечки для гнезд).100 мкл EV, полученных из MC3-LNP, или MC3-LNP, содержащих равную дозу 1,5 мкг мРНК hEPO, вводили мышам внутривенно ( n = 4 на группу). Контрольным мышам вводили 100 мкл PBS. Образцы крови отбирали у групп ( n = 4) мышей с помощью микроспробирования Vena Saphena через 2, 5 и 24 часа после инъекции EV и LNP. Образцы крови, собранные в 35 мкл капиллярных пробирок с ЭДТА, центрифугировали при 1700 × g для сбора плазмы, которую хранили замороженной при -86 ° C до времени для анализа.После 5, 24 и 96 часов инъекции группы мышей были прекращены для сбора органов. Мышам вводили седативную терапию изофлурановой анестезией и производили кровотечение из орбитального синуса с последующим разрезанием сердца. Затем собирали целые органы (печень, почки, селезенку, поджелудочную железу, сердце, тимус, легкие и мозг), мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -86 ° C до времени проведения анализа.

    Обнаружение белка ЕРО человека в плазме мыши

    Для анализа белка hEPO в плазме после доставки мРНК hEPO через MC3-LNP и mc3-EV на платформе Gyros был разработан анализ hEPO.Улавливающее антитело (3F6, диагностика MAIIA) биотинилировали согласно вкладышу набора с использованием набора EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo Scientific). Детектирующее антитело (7D3, диагностика MAIIA) было помечено Alexa 647 с использованием набора для маркировки моноклональных антител (Thermo Scientific). Белок hEPO (собственный) использовали для построения стандартной кривой в буфере Rexxip A (Gyros Protein Technologies) в диапазоне от 12,2 пг / мл до 50 нг / мл. Образцы плазмы мышей разбавляли 1: 1 (об: об) в буфере Rexxip A-max (Gyros Protein Technologies) перед анализом.Образцы анализировали на Gyrolab Bioaffy 1000 CD (Gyros Protein Technologies) с прибором Gyrolab (рабочая станция Gyrolab xP, Gyros Protein Technologies). Для стандартной кривой использовалась 5-параметрическая аппроксимация кривой. Все стандарты и образцы имели CV ниже 10%.

    Обнаружение человеческого белка ЭПО в тканях мыши

    Общий белок из органов экстрагировали с помощью реагента для экстракции белка млекопитающих M-PER (Thermo Fisher Scientific) в присутствии 1% коктейля ингибиторов протеазы остановки (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя .Вкратце, 20–70 мг ткани лизировали в 200–350 мкл буфера для лизиса (в зависимости от веса ткани) с добавлением ингибиторов протеаз (Thermo Fisher Scientific) в Tissue LyserII (Qiagen) в течение 3-5 минут на максимальной скорости. (30 Гц) и центрифугировали при 10000 × g в течение 15 минут при 4 ° C для удаления остатков ткани. Полученный супернатант использовали для количественного определения белка с помощью флуорометра Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific). Пятьдесят микролитров общего белка анализировали для обнаружения белка hEPO с использованием набора Erythropoietin ELISA (STEMCELL Technologies, cat.нет. 01630) в соответствии с инструкциями производителя. Количество белка hEPO (нг) в каждом органе нормализовали по относительной массе органа (г).

    Анализ цитокинов в плазме мышей

    После внутривенного введения MC3-LNP и mc3-EV концентрации цитокинов в плазме крови мышей измеряли с помощью набора MILLIPLEX® MAP Mouse Cytokine от EMD Millipore (№ MCYTOMAG-70K, Merck KGat, Дармштадт, Дармштадт). ) для одновременного количественного определения IL-6, KC, MCP-1, RANTES, TNFα, IFNγ, IL-1β и IP-10.Образцы сначала разбавляли 1: 2 буфером для анализа, а затем вместе со стандартами и QC помещали в 96-луночный планшет. Добавляли раствор, содержащий шарики. Гранулы представляли собой магнитные микросферы, каждая из которых была покрыта специфическим антителом. Смесь инкубировали в течение ночи при 4 ° C, а затем реакционную смесь инкубировали с конъюгатом стрептавидин-PE для завершения реакции на поверхности каждой микросферы. Планшет считывали на анализаторе Bio Rad Luminex 200®. Каждая отдельная микросфера была идентифицирована, и результат ее биоанализа был количественно оценен на основе флуоресцентных репортерных сигналов.Концентрация была измерена с использованием данных средней интенсивности флуоресценции с использованием 5-параметрического метода аппроксимации логистической кривой.

    Обнаружение мРНК человеческого ЭПО в органах мыши

    Полную РНК из органов выделяли с использованием набора RNeasy (Qiagen) в соответствии с рекомендациями производителя. 10-50 мг ткани лизировали в буфере RLT (600 мкл) в Tissue LyserII (Qiagen) в течение 3-4 минут при максимальной скорости (30 Гц) и центрифугировали при 10 000 × g в течение 3 минут при 20 ° C. для истощения остатков тканей.Впоследствии супернатант переносили в колонки и подвергали дальнейшей обработке. РНК количественно определяли с помощью флуориметра Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific), а качество оценивали с помощью NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific) путем измерения отношения 260/230. Исходя из выхода РНК, от 0,5 до 1 мкг общей РНК было преобразовано в кДНК. 100 нг кДНК использовали для количественного определения мРНК hEPO с использованием анализа зонда TaqMan, как описано выше. Количество мРНК hEPO в каждом органе (нг) нормализовали по относительной массе органа (г).

    Статистический анализ

    Статистический анализ был выполнен с помощью GraphPad Prism v.7 (программное обеспечение Graphpad). Данные in vitro были проанализированы с помощью непарного двустороннего теста Стьюдента t , за исключением эффектов введения LNP на рост HTB-177, РНК и количество общего белка в клетках, которые были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с последующим множественным анализом Тьюки. сравнительный тест (значимое значение p <0,05). Содержание hEPO в плазме и органах мышей анализировали с использованием непарного двустороннего теста Стьюдента t , в то время как уровни цитокинов в плазме мышей анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с последующим тестом множественных сравнений Сидака.Уровень значимости p -значений обозначен следующим образом: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 и **** p <0,0001.

    306-O12B LNP более эффективен, чем MC-3 LNP в индукции …

    Контекст 1

    … мРНК Cas9 и sgLoxP были объединены в один единственный LNP и введены мышам Ai14 через хвостовую вену через 1,65 Общая доза РНК мг / кг (Приложение SI, рис. S5A). Органы собирали через 7 дней после родов и визуализировали ex vivo с помощью системы IVIS.Визуализация органов мыши показала, что эта система действительно может вызывать красную флуоресценцию, указывая на успешную функциональную доставку кода как компонентов мРНК, так и sgRNA, и что сигнал tdTomato преимущественно обнаруживался в печени (приложение SI, рис. …

    Контекст 2

    … Рис. S5A). Органы собирали через 7 дней после родов и визуализировали ex vivo с помощью системы IVIS. Визуализация органов мыши показала, что эта система действительно может индуцировать красную флуоресценцию, что указывает на успешную функциональную доставку кода как компонентов мРНК, так и sgRNA, и что сигнал tdTomato преимущественно обнаруживается в печени (приложение SI, рис.S5B). Также было выполнено иммунофлуоресцентное окрашивание на специфический антиген гепатоцитов, и конфокальные изображения продемонстрировали, что большая часть белка tdTomato экспрессируется в гепатоцитах (приложение SI, рис. S5C). Эти результаты показывают, что 306-O12B LNP может специфически транспортировать мРНК и гРНК Cas9 в печень …

    Контекст 3

    … органов мыши показали, что эта система действительно может индуцировать красную флуоресценцию, что указывает на успешную функциональную совместную доставку обоих компоненты мРНК и sgRNA, и сигнал tdTomato преимущественно обнаруживался в печени (приложение SI, рис.S5B). Также было выполнено иммунофлуоресцентное окрашивание на специфический антиген гепатоцитов, и конфокальные изображения продемонстрировали, что большая часть белка tdTomato экспрессируется в гепатоцитах (приложение SI, рис. S5C). Эти данные показывают, что 306-O12B LNP может специфически транспортировать мРНК и гРНК Cas9 в гепатоциты печени. …

    Контекст 4

    … после введения мы наблюдали редактирование в желаемом месте в печени с помощью анализа T7E1 (приложение SI, рис.S7). NGS сайта-мишени Angptl3 в образцах печени дополнительно продемонстрировал, что 306-O12B LNP-опосредованная доставка привела к средней скорости редактирования 38,5%, что значительно выше, чем у MC-3 LNP-опосредованной доставки (14,6%) (рис. 5A). ). Что еще более важно, анализы сыворотки показали, что уровни сывороточного белка ANGPTL3, LDL-C и TG в группе лечения 306-O12B LNP (снижение на 65,2, 56,8 и 29,4% соответственно) были значительно ниже, чем у пациентов, получавших MC-3 LNP. мыши (25, 15,7 и 16.Снижение на 3% соответственно) (рис. 5А). Подробный анализ NGS …

    Контекст 5

    … чем у MC-3 LNP-опосредованной доставки (14,6%) (рис. 5A). Что еще более важно, анализы сыворотки показали, что уровни сывороточного белка ANGPTL3, LDL-C и TG в группе лечения 306-O12B LNP (снижение на 65,2, 56,8 и 29,4% соответственно) были значительно ниже, чем у пациентов, получавших MC-3 LNP. мышей (снижение на 25, 15,7 и 16,3% соответственно) (рис. 5А). Подробный анализ результатов секвенирования NGS показал, что наиболее частым событием редактирования была делеция 1 нуклеотида точно в предсказанном сайте разрезания Cas9 с последующей вставкой 1 нуклеотида в том же месте (рис.5Б). Как и ожидалось, одинаковые события редактирования наблюдались в печени, обработанной MC3 LNP и 306-O12B LNP; the main …

    Context 6

    … соответственно) были значительно ниже, чем у мышей, получавших MC-3 LNP (снижение на 25, 15,7 и 16,3% соответственно) (рис. 5A). Подробный анализ результатов секвенирования NGS показал, что наиболее частым событием редактирования была делеция 1 нуклеотида точно в предсказанном сайте разрезания Cas9 с последующей вставкой 1 нуклеотида в том же месте (рис.5Б). Как и ожидалось, одинаковые события редактирования наблюдались в печени, обработанной MC3 LNP и 306-O12B LNP; основное различие заключалось в частоте этих событий. Это указывает на то, что наблюдаемое снижение компонентов сыворотки, вероятно, было результатом редактирования генома, опосредованного Cas9, и подразумевает, что разница в наблюдаемых результатах между …

    Контекст 7

    … должна приниматься во избежание отклонений от цели редактирование событий или токсичность, вызванная доставкой. Девять наиболее вероятных участков геномного мутагенеза вне мишени были предсказаны с помощью вычислений, и эти локусы были опрошены с помощью NGS ДНК, выделенной из печени.Никаких доказательств редактирования ни на одном из девяти наиболее предсказанных сайтов мутагенеза вне мишени не наблюдалось (рис. 5C). Для оценки токсичности in vivo и потенциального иммуновоспалительного ответа через 48 часов после введения дозы измеряли сывороточные уровни маркеров функции печени аспартатаминотрансферазы (AST), аланинаминотрансферазы (ALT) и провоспалительного цитокина фактора некроза опухоли альфа (TNF-альфа). . Существенных изменений в этих маркерах не произошло …

    CenturyLink | Оптовая | Переносимость местного номера (LNP)

    Перенос местного номера (LNP)

    LNP Описание / Обзор:

    Local Number Portability (LNP) — это процедура, которая направляет вызовы маршрутизации на перенесенные номера, взаимодействие между CenturyLink ™ и вами в сочетании с проводной или беспроводной связью с VoIP LNP.В нем также рассматривается влияние обработки вызовов на других поставщиков телекоммуникационных услуг в среде LNP. LNP позволяет конечным пользователям сохранять те же телефонные номера (TN), когда конечные пользователи переходят от одного местного поставщика услуг к другому в тарифном центре. Перенос из Rate Center (RC) не поддерживается.

    Переносимость местных номеров (LNP) определяется Законом о телекоммуникациях 1996 года как: «способность пользователей телекоммуникационных услуг сохранять в том же месте существующие телекоммуникационные номера без ухудшения качества, надежности или удобства при переключении с одной телекоммуникационной связи. перевозчик к другому.»

    Поддерживаемые типы запросов на перенос: сложные и проекты

    SPID 7575 не поддерживает простые порты, поскольку все поддерживаемые учетные записи являются учетными записями с несколькими номерами. Непростой или сложный запрос на перенос определяется как любой запрос, включающий более одного TN. Непростые / сложные запросы на 50 TN или меньше будут обработаны в течение 24 часов с момента запроса и могут быть перенесены в течение 3 рабочих дней после FOC. Порты проекта — это ICB. См. Раздел «Интервалы портов».Дополнительное примечание: SPID = 7575 поддерживает интервалы LNPA-WG Best Practice 67: http://www.npac.com/lnpa-working-group/lnp-best-practices#0067.

    CSR

    Важно знать, что не все TN имеют записи об обслуживании клиентов (CSR). CenturyLink приложит все усилия, чтобы предоставить информацию о корпоративной социальной ответственности для запросов, когда она будет доступна. Ответы CSR будут доступны на портале LSR.

    SPID (7575) Клиент CenturyLink VoIP:

    Чтобы определить, следует ли направлять запрос на перенос на VoIP клиента CenturyLink (SPID 7575), получающий LEC должен проверить Центры администрирования переносимости номеров (NPAC), чтобы проверить SPID текущего поставщика услуг для телефонных номеров (TN). быть портированным.Клиентский VoIP SPID CenturyLink — 7575. Если нет активной записи в NPAC, получающий LEC должен проверить OCN в LERG, чтобы определить, является ли клиентский VoIP CenturyLink (SPID 7575) текущим поставщиком услуг. Запросы следует отправлять по соответствующим контактам, указанным ниже.

    Направление на портал ЛСР

    LNP CLEC Center Часы работы:

    Понедельник — пятница 8:00 — 17:00 CST
    Суббота, воскресенье, праздничные дни — ЗАКРЫТО

    Выходные дни:

      Новый год, Мартин Лютер Кинг-младший., День президента, День памяти, День независимости, День труда, День благодарения, День после Дня благодарения, Сочельник и Рождество.

    LNP CLEC Контакты центра:

    Интервалы заказа порта
    Комплексный и многополюсный порт (рабочие дни)

    • FOC: 24 часа (1-50 строк)
    • Сроки выполнения: 3-дневный интервал
    • Порты проекта: ICB (51+ или больше линий)
    • Портирование выходных дней будет выполнено без поддержки.

    Руководство по проекту

    51 TN или больше составляет проект. FOC и DD являются ICB (Ссылка LNPA-WG Best Practice 67). CenturyLink сделает все возможное, чтобы предоставить запрашивающей стороне даты важных событий в разумные сроки.

    Порядок обработки заказа :

    Ниже приведен пример шагов, предпринятых в процессе переноса для сложного стандартного запроса даты выполнения. Интервалы не применимы к запросу на перенос проекта ICB.

    Шаг Процесс Результат
    1 CLEC завершает продажу новому конечному пользователю, проверяет CSR и заполняет формы запроса на обслуживание на предоставленном веб-портале. NNSP отправляет запрос на обслуживание в CenturyLink (День 0)
    2 CenturyLink получает и обрабатывает запрос на обслуживание. CenturyLink предоставляет FOC NNSP и отправляет запрос.Подписка создается в NPAC. (День 1)
    3 CLEC получает FOC и отправляет сообщение создания в NPAC, чтобы соответствовать активности подписки Сопоставление активности подписки показывает совпадение.

    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда подписка получена в NPAC от ONSP или NNSP, запускается таймер t1 (9 рабочих часов). Если NNSP или ONSP не соответствуют подписке до истечения таймера t1, тогда таймер t2 запускается и работает 9 рабочих часов.

    Если нет соответствующей подписки от ONSP и истекли таймеры t1 и t2 в подписке NNSP, NNSP может активировать порт на DD без согласования с ONSP.

    Подписка, если она не активирована, отменяется NPAC через 30 дней.

    4 CenturyLink устанавливает 10-значный безусловный триггер не позднее 23:59 за день до DD. (День 2) Набор триггеров из 10 цифр (День 2)
    5 NNSP отправляет активацию в NPAC на порт TN на DD / FDT. Трансляция NPAC отправляется всем поставщикам услуг. (День 3) Трансляция получена, номер перенесен на NNSP.Заказ на обслуживание CenturyLink выполнен. (День 3)
    6 Сервисный заказ выполнен
    7 Отключение и удаление переключателей переводов завершено в CenturyLink

    Частичные портовые выходы

    CenturyLink просит NNSP разместить комментарий в разделе «Примечания», определяющий, какие действия необходимо предпринять в отношении оставшихся услуг.

    Экспедиторов:

    CenturyLink рассмотрит возможность поддержки ускоренного интервала выхода из порта в индивидуальном порядке (через LSR с заполненным полем ускорения) с особым упором на предотвращение выхода из строя служб экстренной помощи (911, полиция, пожарная служба, скорая помощь или медицинские учреждения).Однако это не гарантирует соблюдение сокращенных интервалов.

    Обработка дополнений:

    Чтобы изменить сроки выполнения (DD) или отменить запрос на обслуживание, сделайте дополнение к вашему запросу на обслуживание.

    Примечание. Если дополнение или отмена DD не могут быть отправлены из-за сбоя системы, устные запросы будут приниматься в процессе эскалации. После восстановления системы отправьте дополнение для изменения или отмены DD.

    Чтобы определить правильный процесс изменения и / или отмены DD, следуйте приведенной ниже таблице.

    ЕСЛИ ПРЕДОСТАВЛЯЕТСЯ ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ: ТОГДА:
    До 20:00 по центральному времени по запросу на обслуживание DD Отправьте дополнение к запросу на обслуживание по электронной почте [email protected]
    После 20:00 по центральному времени или до 12:00 по центральному времени на следующий рабочий день после запроса на обслуживание DD Отправьте дополнение к запросу на обслуживание по электронной почте на адрес CLEC-LNP @ CenturyLink.com.

    (Это считается поздним уведомлением.)

    После 12:00 по центральному времени на следующий рабочий день после запрошенного DD

    Отправьте дополнение к запросу на обслуживание по электронной почте [email protected]

    (Это считается поздним уведомлением.)
    До 15:00 по центральному времени, через два рабочих дня после запрошенного DD

    Отправьте дополнение к запросу на обслуживание по электронной почте на адрес CLEC-LNP @ CenturyLink.com

    Свяжитесь с представителем CLEC LNP, чтобы инициировать эскалацию. (Это считается поздним уведомлением.)
    После 15:00 по центральному времени, через два рабочих дня после запрошенного DD
    Примечание. Дополнительные сведения см. В разделе «Неудачная работа порта или отключение конечного пользователя» (OOS).
    Свяжитесь с представителем CLEC LNP, чтобы инициировать эскалацию в случае позднего уведомления.

    Примечание. Вам все равно может потребоваться отправить дополнение, Представитель сообщит вам, если вам потребуется дополнение или новый запрос на обслуживание.

    Три или более дней после запрошенного DD

    Примечание: дополнительную информацию см. В разделе «Неудачная работа порта или отключение конечного пользователя» (OOS).

    Свяжитесь с представителем CLEC LNP, чтобы инициировать эскалацию в случае позднего уведомления.

    Этапы эскалации Примечание. Вам все равно может потребоваться отправить дополнение к вашему запросу на обслуживание. Представитель сообщит вам, если вам потребуется дополнение или новый запрос на обслуживание.

    ПРИМЕЧАНИЕ. Вы можете в любое время связаться с представителем CLEC LNP по поводу вашего запроса на изменение или отмену DD.

    Конечный пользователь не обслуживается (OOS)

    Если конечный пользователь не обслуживается (OOS) и срок платежа (DD) по запросу на обслуживание истек, и вы желаете восстановить службу CenturyLink, вы должны связаться с командой CLEC LNP, чтобы начать «обратную работу» ( WB) в течение 48-часового окна после DD. (Если в нерабочее время необходимо выполнить процедуры эскалации с группой CLEC LNP.) Если ваш запрос «Workback» (WB) включает запрос на отмену будущей активности порта, этот запрос будет обработан устно командой CLEC LNP, и новый запрос на обслуживание не будет требуется.

    «Обратный вызов» происходит, когда конечный пользователь находится в состоянии OOS, а подписка никогда не была активирована в NPAC. Представитель CLEC LNP попросит вас отправить дополнение к существующему запросу на обслуживание (при необходимости) или новый запрос на обслуживание через портал LSR по всем запросам на восстановление обслуживания для конечного пользователя в коммутаторе CenturyLink, когда запрос уже выполнен, и вы желаете перенести дату в будущем.

    CenturyLink начнет процесс восстановления услуги конечного пользователя после получения запроса на обслуживание для будущей активности порта или устного запроса об отмене.Иногда после активации подписки на порт может потребоваться восстановление, эти запросы будут обрабатываться на ICB в рамках того же процесса «Конечный пользователь не обслуживается». Несоблюдение этого процесса может привести к нефатальному отклонению вашего запроса «Workback» и задержке восстановления.

    Справочник:

    Вы несете ответственность за обращение в службу листинга и создание списков для ваших конечных пользователей. Текущие списки каталогов конечного пользователя будут отключены.

    Процесс эскалации переносимости местного номера (LNP):

    Следующий список можно использовать для эскалации. Следуйте по пути эскалации в последовательном порядке. Пожалуйста, не пропускайте уровень эскалации; вы будете перенаправлены на соответствующий уровень, если вы выйдете из процесса.

    Обратите внимание, что CenturyLink CLEC LNP Team не предоставляет поддержку в нерабочее время при переносе. Вам необходимо будет следовать изложенным процедурам восстановления обслуживания клиентов.

    Чтобы выполнить перенос с SPID 2896, отправьте свои запросы CSR по адресу [email protected], а запросы LSR — по адресу [email protected] По дополнительным вопросам обращайтесь по телефону 800-850-9048, опт. 3. Контакты для эскалации для SPID 2896 такие же, как указано выше, однако в настоящее время у нас нет поддержки графического интерфейса для SPID 2896.

    Варианты LNP для миРНК, мРНК или CRISPR

    Издание 2 / декабрь 2018 г.


    Липидные наночастицы (LNP) в клиническом применении: все ли варианты вы рассмотрели?

    Поперечное сечение липидных наночастиц.

    Липидные наночастицы (LNP) являются ведущими системами доставки для реализации терапевтического потенциала малой интерферирующей РНК (siRNA), мРНК для системного применения или CRISPR. Эти системы относительно нетоксичны, что приводит к терапевтическим индексам у мышей, приближающимся к 1000. Катионные липиды широко исследовались на предмет доставки нуклеиновых кислот, с особым вниманием в последние несколько лет на доставку мРНК и миРНК. Они представляют собой амфифильные молекулы, содержащие амин, положительно заряженную головную группу и углеводородную цепь или производное холестерина, присоединенные через линкер (например,грамм. глицерин). Положительно заряженная головная группа липида может электростатически взаимодействовать с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами и обеспечивать их захват наночастицами на основе липидов. Системы миРНК LNP, содержащие оптимизированные ионизируемые катионные липиды, могут проявлять замечательную активность in vivo при дозах всего 0,02 мг миРНК / кг веса тела для подавления подавления генов-мишеней печени (гепатоцитов) у грызунов после внутривенной инъекции.

    Использование катионных липидов для трансфекции мРНК in vitro было впервые описано более 20 лет назад путем образования комплекса мРНК в липосоме, содержащей синтетический катионный липид N- [1- (2,3-диолеилокси) пропил-N, N , N-триметиламмонийхлорид (DOTMA) и вспомогательный липид диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), обеспечивающий высокий уровень транслируемого белка.

    Наиболее распространенные составы миРНК содержат четыре компонента: аминосодержащий липид или липидоподобный материал, фосфолипид, холестерин и липидно-заякоренный полиэтиленгликоль, относительные соотношения которых могут иметь сильное влияние на эффективность состава. ONPATTRO TM , например, который показан для лечения полинейропатии наследственного транстиретин-опосредованного амилоидоза у взрослых, вводится внутривенно (в / в) в дозе 0,3 мг / кг один раз в 3 недели (пациенты с массой тела менее 100 кг).LNP состоит из siRNA (ALN-18328), холестерина USP, DLin-MC3-DMA, DSPC, PEG 2000 -C-DMG в соотношении (2: 6,2: 13: 3,3: 1,6) и некоторых солей ( фосфат калия, одноосновный безводный NF, хлорид натрия USP, двухосновный гептагидрат фосфата натрия USP) в воде для инъекций (WFI). Совсем недавно патисиран был разработан для нацеливания на продуцирование печенью дикого типа (wt) и мутантного TTR с использованием очень похожего состава LNP.

    Ионизируемые липиды и липидные наночастицы: инициативы по обеспечению более низких доз

    Значительные усилия были приложены для открытия и разработки носителей, которые могут направлять малые интерферирующие siRNA через множество барьеров, охраняющих внутреннюю часть клеток-мишеней.Повышение эффективности доставки потребовалось для раскрытия самого широкого потенциала терапевтических средств РНК-интерференции. Путем комбинаторного синтеза и скрининга материалов другого класса был идентифицирован состав, который позволяет siRNA-направленное подавление гена печени у мышей при дозах ниже 0,01 мг / кг. Потенциал этой композиции был дополнительно подтвержден на приматах, кроме человека, где высокие уровни нокдауна клинически значимого гена транстиретина наблюдались при таких низких дозах, как 0.03 мг ∕ кг. Был проведен скрининг различных хвостов и аминогрупп, в результате которого были получены интересные результаты структура-активность. Что касается длины хвоста, большинство наиболее эффективных структур обладали хвостами, состоящими из 14 атомов углерода. Кроме того, никакие соединения с длиной хвоста менее 12 атомов углерода не опосредуют сайленсинг более 30%. Что касается головных аминогрупп, то в наиболее эффективных соединениях присутствует третичный амин. С тремя верхними липоидами была проведена доставка in vivo миРНК к гепатоцитам мышей и получено дозозависимое подавление гена.В частности, одно соединение, C12-200, продемонстрировало более чем на два порядка более высокую эффективность по сравнению с LNP01.

    CordenPharma Switzerland, расположенная недалеко от Базеля в Листале, Швейцария, освоила полный химический синтез сложных производных фосфолипидов от нескольких граммов до нескольких килограммов (например, DSPG, DPPC, DSPC, SCS, производные MPEG) и известны своими производными контракт на экспертизу производства липидов и фосфолипидов. Недавно мы разработали производственный процесс для C12-200, который теперь готов для оценки потенциальными клиентами, ищущими прорыв в LNP.C12‑200 доступен с высокой степенью чистоты, а процесс достаточно надежен для проведения кампании GMP.

    Чтобы получить дополнительную информацию или получить бесплатный образец C12-200 (до 50 мг), пожалуйста, Свяжитесь с нами .


    Подпишитесь на нашу рассылку новостей

    Будьте в курсе последних научных статей и новостей от CordenPharma.

    Cell Therapy — Как разработать клеточную терапию

    Структура

    Precision NanoSystems предназначена для руководства разработкой невирусных генетических лекарств, таких как RNA-LNP, от идеи до коммерческого продукта. В клеточной терапии РНК-LNP используется в качестве реагента, а не лекарственного препарата. Тем не менее, как показано ниже, аспекты структуры могут быть использованы для руководства и ускорения оптимизации реагента для репрограммирования РНК-LNP ex vivo, который имеет решающее значение для производства продукта клеточной терапии.

    Структура и инструментарий генетической медицины поддерживает разработку реагентов для перепрограммирования клеточной терапии

    Примеры спецификаций для РНК-LNP, используемого в качестве реагента для инженерии клеток для создания клеточной терапии, показаны в таблице ниже.

    Начните с 2 мкг / 1 миллион Т-клеток

    Индекс пролиферации клеток после обработки

    Эффективность инкапсуляции РНК

    Эффективность трансфекции

    (Первичные Т-клетки человека)

    Жизнеспособность клеток

    (Первичные Т-клетки человека)

    1.Выбор мишени

    Антигены обычно выбирают из биомаркеров, которые, как известно, чрезмерно экспрессируются в раковых клетках. Антигенсвязывающий домен scFV антител, индуцированных для связывания биомаркера рака, кодируется в мРНК вместе с трансмембранным доменом и стимулирующими и костимулирующими молекулами эндодомена для создания CAR. МРНК

    обеспечивает удобную платформу для смешивания и сопоставления нескольких антигенсвязывающих доменов с множеством стимулирующих и костимулирующих доменов для создания библиотеки CAR in silico, которую можно подвергать скринингу in vitro и in vivo .Кроме того, простота инкапсуляции в невирусные системы доставки, такие как липидные наночастицы (LNP), обеспечивает быстрый подход к скринингу большой библиотеки различных CAR.

    2. Выбор вектора

    Экспрессия экзогенных белков в Т-клетках: CAR может кодироваться в мРНК и доставляться в Т-клетки ex vivo с помощью липидных наночастиц. мРНК-LNP имеют несколько преимуществ перед ДНК, доставляемой вирусными векторами: (1) Бесклеточное производство проще и хорошо масштабируется от проверки мишени до производства в промышленных масштабах.(2) мРНК представляет меньший риск интеграции генома.

    Редактирование генов: Инструменты, такие как CRISPR / Cas9, представляют собой прорыв в клеточной терапии, обещая возможность удалять, добавлять или редактировать геномную ДНК с высокой специфичностью. Остаются многочисленные проблемы с доставкой в ​​клетки компонентов CRISPR, таких как эндонуклеаза Cas9 и единственная направляющая РНК. На сегодняшний день несколько групп продемонстрировали, что эндонуклеаза Cas9 может кодироваться в мРНК и совместно инкапсулироваться с одной или несколькими направляющими РНК в LNP и доставляться в печень in vivo [1,2].Этот подход приводит к очень стойкой модуляции генов, в то время как временная природа мРНК Cas9 сводит к минимуму риск нецелевых изменений, вызванных устойчивой экспрессией Cas9. Можно использовать этот подход, чтобы сделать возможным редактирование генов в других типах клеток.

    3. Технология доставки и приготовления препаратов
    Precision NanoSystems разработала липидную библиотеку специально для доставки генов в широкий спектр клеток, включая Т-клетки. Технология липидных наночастиц (LNP) PNI представляет собой инструмент доставки синтетических генов, который не требует сложностей, связанных с упаковкой клеточной линии.Это особенно полезно для быстрого скрининга библиотеки CAR. Кроме того, PNI LNP могут быть легко адаптированы для введения мРНК в различные подмножества Т-клеток.

    Технология доставки GenVoy ™ LNP

    Универсальное использование в нескольких подгруппах Т-клеток

    Первичные CD4, CD8 и пан-Т-клетки человека после активации обрабатывали GFP-мРНК-LNP, что приводило к сравнимой экспрессии трансгена.

    4. Производство
    Производственная платформа NanoAssemblr® позволяет быстро производить RNA-LNP по запросу. Платформа NanoAssemblr состоит из четырех систем (Spark, Ignite, Blaze и GMP), которые используют ту же запатентованную микрофлюидную архитектуру NxGen ™ для масштабирования производства от микролитров до сотен литров. Нетурбулентное микрожидкостное перемешивание обеспечивает исключительный контроль над микросредой образования РНК-LNP, обеспечивая высокое качество продукта.Для приложений клеточной терапии объем реагента РНК-LNP, необходимый для перепрограммирования клеток, будет зависеть от рабочего процесса данного приложения.

    Платформа NanoAssemblr ™ с технологией NxGen

    Тестовые партии объемом до 20 л / ч, полученные с помощью одного смесителя NxGen, при сохранении характеристик частиц (размера и PDI) и биологической активности.

    Узнать больше

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *